禽网状内皮增生病活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及用自禽网状内皮增生病患病鸡分离到的野毒株经过人工诱变处理获得一株弱毒病毒株，用ＳＰＦ鸡胚成纤维细胞制成预防禽网状内皮增生病活疫苗，该活疫苗用于接种开产前的种鸡，使种鸡在开产前产生抗体从而不再发生病毒血症，并可为雏鸡提供母源抗体。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及禽类，特别是鸡的一种病毒性传染病的预防用活疫苗，属兽用生物制品领域。禽网状内皮增生病病毒或禽网状内皮增殖病病毒(REV)是一群可在多种鸟类诱发慢性肿瘤的反转录病毒。虽然该病毒不属于国际兽医局(OIE)列出的A或B类病毒，但近来国内许多单位的研究都发现，REV感染在我国非常普遍。它是造成动物用疫苗污染的最常见的外源病毒，它与其它病毒共感染时可造成鸡群的免疫抑制从而降低多种疫苗的免疫效力，也常与其它肿瘤病毒混合感染后大大提高了肿瘤的发病率。因此，REV感染已在我国养鸡业中造成很大危害。然而迄今为止，国内外均没有预防控制REV感染的疫苗。REV感染造成的危害最主要是由种鸡的垂直感染(相应鸡胚造成的鸡胚源疫苗污染的来源)或雏鸡的早期感染，如果能让种鸡在开产前全部产生抗体从而不再有病毒血症并可为雏鸡提供母源抗体，就可以预防这一危害的发生。本专利技术的目的是为研制出用于预防安全、高效的疫苗用于开产前的种鸡，使种鸡在开产前全部产生抗体从而不再有病毒血症发生，并可为雏鸡提供母源抗体。本专利技术的关键技术是以用自患病鸡分离到的禽网状内皮增生病病毒野毒株经过在SPF来源的鸡胚成纤维细胞(CEF)上反复蚀斑纯化后得到的致弱毒株，使其对健康鸡致病性减弱或无致病性，制备成活疫苗，接种种鸡，使种鸡在开产前全部产生抗体从而不再有病毒血症发生，并可为其雏鸡提供母源抗体，从而抵御强毒的攻击。本专利技术的具体描述1毒株禽网状内皮增生病致弱毒株REV-C99株是将一野毒株在SPF来源的鸡胚成纤维细胞上经反复蚀斑纯化后得到的致弱毒株，经用经典的和分子病毒学方法检测证明无其它已知病毒(该病毒已于2001年07月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.1429)。2SPF CEF细胞制备按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》2001年版规定的方法制备SPF CEF细胞。3弱毒株的生物学特性3.1在饲养在隔离器内的3周龄SPF鸡的接种试验证明，该克隆纯化的毒株REV-C99病毒不引起明显临床症状，在3周内可诱发很高的抗体，且无横向传播能力(同一隔离罩内的对照鸡在70天内抗体仍是阴性)。肉用型父母代种鸡在18周接种REV-C99病毒后，种鸡没有表现任何不良反应，在增重、性成熟、开产期、产蛋高峰产蛋率都达到规定指标，对其它疫苗免疫后的抗体水平也没有影响。3.2所有接种REV-C99病毒的鸡均在2周内产生抗体，并至少持续9个月。3.3接种REV-C99病毒的鸡所产蛋的卵黄囊中均显对REV的特异抗体。3.4开产后不同时期所产蛋在孵化至10～12天时做细胞培养，在所检的30个蛋中，没有一个显示垂直感染。4安全性试验试验一SPF鸡的安全性试验用饲养在带正压过滤空气装置的隔离器内的3周龄SPF鸡的接种试验证明(每只鸡2×107TCID50/0.2ml)，该病毒不引起明显临床症状，在3周内即可诱发很高的抗体，且无横向传播能力(同一隔离罩内的对照鸡在70天内抗体仍是阴性)。试验二肉用型种鸡的安全性试验(1)不同剂量的安全性试验在三组17周龄肉用型种鸡(每组20只)分别接种3×107TCID50/0.3ml、0.6×107TCID50/0.3ml及1.2×106TCID50/0.3ml量的REV-C99病毒。观察10天，三组鸡在试验观察期内均无不良反应。(2)中等剂量重复试验500羽18周龄父母代肉用型种鸡，每羽按中等剂量即0.6×107TCID50/0.3ml的REV-C99病毒。连续观察108天。结果如下①临床表现无任何临床表现②对生产性能的影响按正常生产规程记录生产性能，其开产前体重、开产期、产蛋高峰期、产蛋率、受精率及孵化率均达到AA肉鸡生产手册的标准。实际上达到了实施实验的公司历年来的最好记录(正因为如此，实施公司主动要求提前做田间扩大试验)。③免疫鸡群的REV垂直传播状态分别在开产(23周龄)，产蛋高峰前期(31周龄)和中期(35周龄)采集蛋，孵化至10～12天后，做成细胞培养。在7～10天后，用对REV的单抗做间接荧光抗体试验。结果证明在三个时期采集的蛋中均无REV垂直感染，分别是0/24、0/17、0/12。④对种鸡肿瘤发病率的影响观察至38周龄，未见肿瘤病例。证明该病毒在18周龄接种不会引起后期肿瘤。5效力试验将根据种鸡对REV抗体的阳性率、预防垂直传播、雏鸡的母源抗体状态、雏鸡对REV攻毒的抵抗力来判断。5.1种鸡的抗体动态不论用5倍量、1倍量和0.2倍量接种的所有60只鸡，在10天均出现抗体，用REV antibody test kit(IDEXX loboratories，Inc.产品)检测血清中对REV的抗体，其平均值分别为1.116、1.079、0.981(各为20只鸡)，远远高于试剂盒说明规定的0.2的阳性标准。在接种后280天检测，所有鸡仍保持抗体阳性。5.2雏鸡的母源抗体免疫鸡在开产后的产蛋孵出的小鸡，在3天后采血清，用IDEXX试剂盒检测REV抗体，100％阳性(20/20)。5.3对REV垂直感染的预防作用如二(c)所述，检测免疫鸡在不同时期采集的53个蛋(24，17，12)，孵化至10～12天时，制成CEF，再培养5～7天后，用REV单抗做IFA检测病毒，100％阴性。这表明，这些鸡不仅没有疫苗毒的垂直感染，在这些鸡蛋中也没有野毒垂直感染。5.4雏鸡对REV人工感染的抵抗力将分别从免疫种鸡(100％呈现REV抗体)所产蛋孵出的雏鸡及从非免疫同批种鸡(但由于自然感染仍有10％左右已被感染过，呈现抗体阳性)孵出的雏鸡各90羽，分别置于带正压过滤空气的不同隔离罩中饲养(前二周)，同时在1日龄时分别接种低代次REV(106TCID50/0.2ml)。每组中分别保留16只不接种REV做对照。经REV免疫组种鸡的后代在REV感染3周后的平均体重为610g，与未接种REV的对照鸡无区别。未免疫对照种鸡的后代在REV感染3周后平均体重为470g(同批未攻毒对照为610g)。两组差异极显著。这表明免疫后种鸡为雏鸡提供的母源抗体可有效地保护雏鸡抵抗REV的早期感染。6禽网状内皮增生病活疫苗的制备以10～11日龄SPF鸡胚制备CEF单层细胞，按0.1％质量比将REV-C99病毒的种子混于细胞培养维持液中(含2％～4％犊牛血清的DMEM液，pH7.4)，37℃培养5～6天，收获病毒细胞培养液；将收获病毒细胞培养液充分混合后直接分装成液体活苗，测定病毒TCID50，以≥107TCID50/mL为合格；将收获病毒细胞培养液加入常用的冻干保护剂，充分混合后分装后经冷冻干燥而制成冻干活疫苗，测定病毒TCID50，以≥107.0TCID50/mL为合格。7疫苗安全性测定取制备的活疫苗，腿部肌肉接种3周龄健康鸡各5羽，按每只鸡2×107TCID50/0.2ml的剂量(含20个使用剂量)，观察10天，均未见不良反应。8疫苗免疫效力测定建议在16～20周龄(开产前3周)腿部肌肉接种免疫，剂量为每羽106TCID50/0.2ml。在免疫后2周内，采10只鸡血清用REV抗体ELISA检测试剂盒检测(IDEXX loboratories，Inc.产品)，应全部为阳性。本专利技术的优点本专利技术所涉及的禽网状内皮增生病活疫苗用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鸡网状内皮增生病活疫苗及其制备方法，其特征是用由患病鸭分离到强毒株经过人工诱变处理获得的一株致弱的ＲＥＶ－Ｃ９９株病毒，该病毒株已于２００５年７月２８日保藏在中国微生物保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为ＣＧＭＣＣＮｏ．１４２９，将以上致弱毒株通过接种细胞单层细胞，３７℃培养５～６天，收获病毒细胞培养液；将收获病毒细胞培养液充分混合后直接分装成液体活苗测定病毒ＴＣＩＤ↓［５０］，以≥１０↑［７］ＴＣＩＤ↓［５０］／ｍＬ为合格；将收获病毒细胞培养液加入常用的冻干保护剂，充分混合后分装后经冷冻干燥而制成冻干活疫苗，测定病毒ＴＣＩＤ↓［５０］，以≥１０↑［７．０］ＴＣＩＤ↓［５０］／ｍＬ为合格。

【技术特征摘要】
1一种用于鸡网状内皮增生病活疫苗及其制备方法，其特征是用由患病鸭分离到强毒株经过人工诱变处理获得的一株致弱的REV-C99株病毒，该病毒株已于2005年7月28日保藏在中国微生物保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCNo.1429，将以上致弱毒株通过接种细胞单层细胞，37℃培养5～6天，收获病毒细胞培养液；将收获病毒细胞培养液充分混合后直接分装成液体活苗测定病毒TCID50，以≥107TCID50/mL为合格；将收获病毒细胞培养液加入常用的冻干保护剂，充分混合后分装后经冷冻干燥而制成冻干活疫苗，测定病毒TCID50...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔治中，孙淑红，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]