本发明专利技术属于分子免疫学和病毒学交叉技术领域，具体选取了禽网状内皮组织增生症病毒（REV）env基因相对保守区域共1200bp的基因片段，该片段表达的400个氨基酸包涵了REV病毒90%以上的抗原位点，这样既保留了病毒绝大部分的抗原位点又排除了因基因变异带来的干扰，利用含有该保守基因片段的env基因获得原核表达产物His-env融合蛋白，免疫Balb/C小鼠，经瘤细胞SP2/0与被免疫小鼠的脾细胞融合，筛选和克隆得到REVENV蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体为禽网状内皮组织增生症的诊断预防及科学研究提供技术支撑。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子免疫学和病毒学交叉
，具体涉及一种由杂交瘤细胞分泌的禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白(ENV)保守序列的单克隆抗体及其制备方法。
技术介绍
禽网状内皮组织增生症(RE)是由禽网状内皮组织增生症病毒(REV)引起的以网状细胞增生为主要特征的一组综合症(Witter R. L，1997)，包括急性网状细胞增生症、矮小综合征和淋巴组织及其它组织的慢性肿瘤增生性疾病，可引发为严重的生长抑制和免疫抑制。继禽马立克氏病和禽白血病之后，RE是迄今己经确定的禽类第三种传染性肿瘤病。除已知火鸡、鸡、鸭、鹅、日本鹌鹑等家禽可感染不同的REV毒株外，还从野鸭、野火鸡以及野生鸟类中分离到该病毒。研究显示，目前，我国商品化鸡群REV抗体阳性率普遍偏高，有的地区更是高达80%。净化鸡群，减少REV对禽类生产的危害任重道远。1、REV病毒的囊膜蛋白REV基因组编码gag、pol和env三个结构蛋白。其中env基因编码的囊膜蛋白(ENV) 包涵了 REV病毒99%以上的抗原位点。世界各地学者对REV研究发现，其env基因为该病毒的高变区域，极易发生突变。基于erw表面蛋白基因gp90制备的单抗不能排除REV突变的影响，很大程度上影响了 RE疾病的诊断精准率。以erw基因中保守区域制备单抗，既保留了病毒绝大部分的抗原位点又排除了因基因变异带来的干扰，将有效的提高REV诊断的精准率。2、禽网状内皮组织增生症的诊断方法研究现状目前对禽网状内皮组织增生症的诊断，可通过临床剖检和组织病理学检查初步诊断， 进一步确诊需要通过PCR、免疫组织化学、间接免疫荧光和ELISA等方法。PCR技术容易受到很多因素干扰，并可能出现假阳性和假阴性结果；目前我们使用的ELISA单克隆抗体试剂盒产于国外，价格昂贵，检测成本高，不利于大规模的鸡群检测和净化。免疫组织化学和间接免疫荧光方法检测REV、制备国产化抗体检测试剂盒均需要高特异性的单克隆抗体。研制出廉价高效且具有代表性的单克隆抗体，对净化集群，减少REV对养禽业带来的损失势在必行。
技术实现思路
针对于env基因编码的囊膜蛋白因基因突变带来的各种不便，本专利技术选取了 env 基因的相对保守区域共1200bp的基因片段，该片段表达的400个氨基酸包涵了 REV病毒 90%以上的抗原位点，这样既保留了病毒绝大部分的抗原位点又排除了因基因变异带来的干扰，利用含有该保守基因片段的env基因获得原核表达产物His-env融合蛋白，免疫 Balb/C小鼠，经瘤细胞SP2/0与被免疫小鼠的脾细胞融合，筛选和克隆得到REV ENV蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体可有效地防止因REV突变对诊断效果的影响，为禽网状内皮组织增生症的诊断、预防提供科学基础和技术支撑。本专利技术提供的由杂交瘤细胞分泌的REV囊膜蛋白的单克隆抗体；是通过如下具体步骤获得的根据REV标准毒株SNV株的前病毒基因组DNA erw基因两端的一段序列作为引物。上游引物为 5，-CCGGAATTCGCCATCCTACAGAAAACAAA-3，其基因序列如 SEQ ID NO. 2 所示，下游引物为 5，-CGACTCGA- GAACAATATGAGCCCAAACA- 3，其基因序列如 SEQ ID NO. 3 所示，并在引物中分别添加了 EcoR I和Xhol I酶切位点。PCR扩增，DNA纯化试剂盒纯化PCR产物， 利用pET-28a获得重组载体pET-28a-env重组质粒，将该重组质粒按常规方法转化入CaCl2 法制备的感受态细胞BL21，酶切法鉴定阳性克隆，阳性克隆送往测序公司测序，最终获得的 env基因其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。将上述含有重组质粒的BL21菌接种于含氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基培养，使用0.4mmol/L IPTG诱导表达出了带有HIS标签的融合蛋白His-env，得到以包涵体形式表达His-env蛋白。通过透析得到的上清即为纯化完成的His-env融合蛋白。使用 SDS-PAGE法检测纯化后的蛋白，其分子量为45KD。得到的蛋白经过Bradford法测定蛋白含量，稀释到0. 5mg/ml分装_20°C保存备用。将上述获得的纯化后的原核表达产物His-env融合蛋白免疫Balb/C小鼠，经瘤细胞SP2/0与被免疫小鼠的脾细胞融合，通过生物免疫学技术，筛选和克隆得到能分泌禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，专利技术人将该杂交瘤细胞进行生物保藏，保藏号为CGMCC NO 5019，保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏时间为 2011年7月18日。由上述杂交瘤细胞分泌的REV囊膜蛋白(ENV)的单克隆抗体(以下简称单抗1)， 可与REV的囊膜蛋白受体特异性结合；长势良好的该杂交瘤细胞在其培养液中常规培养2-3天，培养液由橘红色变为黄色， 这就表明该培养液中含有该杂交瘤细胞株分泌出的单克隆抗体，即单抗1 ；经间接免疫荧光方法检测，该单抗1与接种REV的DF-I细胞特异性的结合，在荧光显微镜下观察，细胞膜及细胞浆呈现明亮的荧光信号，细胞内的细胞核区域无荧光；经酶联免疫吸附方法检测，酶标仪测OD值单抗1与纯化后的原核表达产物His-env融合蛋白可发生特异性结合，其OD 值与阴性对照的OD值得比值不小于2 ；通过转印免疫印迹方法检测单抗1，结果发现单抗1 能与目的蛋白特异性的结合，并确定表达蛋白的分子量。基于上述的理由，本专利技术所获得的单克隆抗体为检测、预防禽网状内皮组织增生症奠定了基础。在筛选杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体时，为了获得抗REV ENV蛋白的单克隆抗体， 可采用下述三种方法1.将纯化后的原核表达产物His-env融合蛋白与该单抗1在体外结合，采用酶联免疫吸附方法筛选抗REVHis-env的单克隆抗体，筛选时发生了特异性结合的OD值与阴性对照的OD值比值不小于2 ；2.将纯化后的原核表达产物His-env融合蛋白与该单抗1在体外结合，采用转印免疫印迹方法确定与抗体发生结合反应的蛋白分子量，在45KD处出现一条特异性的蛋白条带， 与预计的蛋白分子量相符，筛选获得抗REV His-env的单克隆抗体。3.将REV SNV标准株接种DF-I细胞，使该单抗1与病毒结合，采用间接免疫荧光筛选抗REV His-env的单克隆抗体，筛选时与接种REV SNV的特异性结合的，在荧光显微镜下观察，细胞膜呈现明亮的荧光信号，细胞内的细胞核区域无荧光。通过上述方法筛选出的单克隆抗体，具有如下的优点1虽然国外特异性检测REV抗体的单克隆抗体检测试剂盒已经商品化，但由于昂贵， 很难大范围使用。REV嚢膜蛋白(ENV)包涵了 REV病毒99%以上的抗原位点，是作为检测 REV抗体的首选抗原。但是经世界各地学者研究发现，erw基因属于该病毒的高变区域，极易发生突变。因此经过比对REV病毒多个毒株，本专利技术选取了 erw基因的相对保守区域共 1200bp的基因片段，该片段表达的400个氨基酸包涵了 REV病毒90%以上的抗原位点，这样既保留了病毒绝大部分的抗原为点又排除了因基因变异带来的干扰。2本专利技术适用于大规模批量生产，经过进一步的研究会根据该单克隆抗体开发出针对REV的治疗药物和疫苗，一旦得到有利推广本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的单克隆抗体，其特征在于：是由保藏号为ＣＧＭＣＣ ＮＯ ５０１９的杂交瘤产生的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：成子强，王峰，张利，王桂花，王玥，于琳琳，姜艳萍，王晓伟，陈洪博，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：37
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