本发明专利技术公开了一种环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备方法，包括环丁烷嘧啶二聚体光修复酶的表达、环丁烷嘧啶二聚体光修复酶的纯化和环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备三个步骤；该方法采用Q柱对环丁烷嘧啶二聚体光修复酶进行分离，介质价格便宜，而且分离去除谷胱甘肽-S-转移酶的效果更好，更适于环丁烷嘧啶二聚体光修复酶的产业化生产；本发明专利技术还将环丁烷嘧啶二聚体光修复酶制备为脂质体，使环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体能穿透细胞膜或者皮肤的屏障进入细胞，大大提高DNA损伤的修复效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于DNA光修复酶制备领域，特别涉及。
技术介绍
环丁烧嘧啶二聚体光修复酶(cuclobutanepyrimidine dimmer photolyase,CPDase)是生物体利用光修复DNA损伤的主要工具。CPDase广泛分布在各种物种之中，是一种分子量 在55-65kD间的单体蛋白，人体内尚未发现CPDase。目前在全球范围内，随着环境破坏与紫外线到达地面的剂量与强度的增加，皮肤病尤其是皮肤癌的发病率逐年上升，原因是太阳光中的紫外线会对生物体内的大分子造成伤害，使DNA产生环丁烷嘧啶二聚体(cuclobutane pyrimidine dimmer, CPD)等光产物。CPD损伤在人体中很难被NER途径等DNA损伤修复系统修复，这势必会使常常暴露于日光下的人群中出现CPD光产物的积累，该损伤的积累将会影响DNA的复制与转录，造成免疫抑制及红斑的产生，长期大量的积累会造成DNA的突变，进而造成癌变，而CPDase可有效清除紫外线照射细胞形成的CPD光产物，在防止紫外线损伤方面具有良好的效果。目前，关于CPDase的制备方法国内外有相关专利和文献进行报道。国外已有文献报道不同来源CPDase的制备方法，包括基因克隆、蛋白质表达、纯化制备，这些CPDase纯化制备方法，主要采用传统的蛋白质纯化方法，即利用该蛋白质的溶解度、等电点、带电荷数、疏水性等理化特征进行分步纯化。美国《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.1984,259,6028-6032)报道，在制备大肠杆菌的CPDase时，采用基因克隆方法，将大肠杆菌CPDase基因构建到重组质粒，并使该重组质粒能在表达菌株中过量表达；收集、破碎表达后的菌体，离心收集的可溶上清液用硫酸铵沉淀，随后依次用苯基-琼脂糖柱层析、羟基磷灰石柱层析、二乙氨乙基-琼脂糖柱层析、DNA-纤维素柱层析和苯基-琼脂糖柱层析进行分步纯化。据美国《突变研究》(Mutation Research, 1996, 33,97-104)报道,在纯化果蚬CPDase时，构建一种CPDase基因重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌后，在表达菌株中过量表达，菌液经破碎、离心后，取可溶性上清液经硫酸铵沉淀蛋白质，随后经过蓝色-琼脂糖柱层析和DNA-纤维素柱层析进行两步亲和层析纯化蛋白质；但蓝色-琼脂糖和DNA-纤维素柱基质价格非常昂贵，在分离过程中也会存在一些非特异性吸附蛋白质的影响。因此，上述的纯化方法虽然能得到很纯的样品，但其纯化步骤繁杂，纯化周期长，因纯化过程中要多次更换层析柱，使样品处理过程复杂、蛋白质回收率低，使用的原理昂贵，不适合规模化批量制备蛋白质。最为重要的是，制备的CPDase不能穿透细胞膜或者皮肤的屏障进入细胞，从而导致DNA损伤修复效果不明显。另夕卜，特异性高的亲和层析方法是蛋白质制备的重要手段，专利技术专利200310106550.3中描述CPDase的亲和制备，包括扩增CPDase基因，构建到带有组氨酸-标签的载体质粒中；过量表达CPDase，离心收集菌液，高压破碎菌体，将离心分离出的上清液加入已结合镍离子并用含0.005-0.05mol/l咪唑的缓冲液平衡过的镍离子亲和层析柱内，用含0.005-0.05mol/l咪唑的缓冲液洗去不能结合或非特异性结合的杂蛋白，再用含0.5-1.0mol/1咪唑的缓冲液或者镍离子螯合剂洗脱，收集洗脱样品，透析，冷冻干燥，即得到CPDase。这种方法制备的CPDase含有外源组氨酸标签，这种标签可能会对CPDase的正常结构和功能造成影响，并对后续的应用带来潜在的安全隐患。国外在采用特异性高的亲和层析方法纯化另一种光修复酶时，对引入的外源标签进行去除。据美国《生物化学杂志》(J.Bi0.Cheml997，272，32591-32598)报道，在纯化非洲爪蛙属(6_4)光修复酶时，是将基因重组构建到一个含谷胱甘肽-S-转移酶基因的重组质粒中，在表达菌株中过量表达，其蛋白质表达的产物为羧基端带有谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白质，通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析柱一步纯化得到很纯的融合蛋白质，然后用凝血酶切除谷胱甘肽-S-转移酶，最后利用DNA亲和柱纯化。这种方法利用的DNA亲和柱价格昂贵，而且条件不容易控制，不利于该蛋白质规模化生产。这些方法制备的CPDase同样不能穿透细胞膜或者皮肤的屏障进入细胞，从而导致DNA损伤修复效果不明显。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，该方法克服现有方法纯化层析柱基质价格昂贵、不适宜于规模化制备环丁烷嘧啶二聚体光修复酶的缺陷，而且提高环丁烷嘧啶二聚体光修复酶穿透细胞膜或者皮肤屏障的能力，大大改善DNA损伤修复效果。为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是:提供，其特征在于，包括以下步骤:a、环丁烷嘧啶二聚体光修复酶的表达:从生物体中克隆到环丁烷嘧啶二聚体光修复酶基因，将该基因构建到原核表达载体P GEX4T-1中，再转化至大肠杆菌表达菌株E.coliBL21感受态细胞，得到菌液；在3 50ml含氨苄青霉素的LB培养基中加入LB培养基体积I 5%的菌液，37°C培养至OD6tltl为0.6 0.8 ;再加入IPTG至终浓度为0.1 0.8mol/L，23 28°C诱导表达3 4h，在10000 12000个重力加速度条件下离心沉淀菌体，收集菌体，将菌体进行 超声波破碎，破碎后的菌体液于10000 12000个重力加速度条件下离心去除菌体碎片，收集离心分离出的上清液，得到环丁烷嘧啶二聚体光修复酶粗品；其中，超声波破碎的条件为:在200 400W的功率下，工作时间I 5s，间歇时间2-5s，超声破碎20-40min ；b、环丁烷嘧啶二聚体光修复酶的纯化:将步骤a制得的环丁烷嘧啶二聚体光修复酶粗品以100 150ml/h的流速加入到谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱内，用5 10倍柱床体积的洗脱液A以200 400ml/h的流速进行淋洗，再以5 10倍柱床体积的洗脱液A和洗脱液B进行梯度洗脱，得到融合环丁烷嘧啶二聚体光修复酶；再按照l_5U/mg蛋白质的用量，将凝血酶加入到融合环丁烷嘧啶二聚体光修复酶中，37°C酶解I 3h，切除谷胱甘肽-S-转移酶，得到酶切水解液；将酶切水解液以100 150ml/h的流速加入到Q柱中，用5 10倍柱床体积的洗脱液C以200 400ml/h的流速进行淋洗，再以5 10倍柱床体积的洗脱液C和洗脱液D进行梯度洗脱，得到环丁烷嘧啶二聚体光修复酶；再将环丁烷嘧啶二聚体光修复酶进行脱盐柱脱盐处理，得到高纯度的环丁烷嘧啶二聚体光修复酶；其中，洗脱液A 由 50mM Tris/HCl 和 0.15MNaCl 组成；洗脱液 B 由 50mMTris/HCl和IOmMGSH组成；洗脱液C由IOmM PB和0.15MNaCl组成；洗脱液D由IOmM PB和IMNaCl组成；C、环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备:称取50 IOOmg卵磷脂和20 50mg胆固醇,溶解于7.5 15ml乙醚中，加入0.1 0.5mg步骤b制得的高纯度环丁烧U密啶二聚体光修复酶，再进行超声乳化，形成油包水，再进行蒸馏去除低沸点有机相，得到环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体混悬液；再继续蒸发，直至白色悬液形成；将白色悬液本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a、环丁烷嘧啶二聚体光修复酶的表达：从生物体中克隆到环丁烷嘧啶二聚体光修复酶基因，将该基因构建到原核表达载体p?GEX4T?1中，再转化至大肠杆菌表达菌株E.coliBL21感受态细胞，得到菌液；在3～50ml含氨苄青霉素的LB培养基中加入LB培养基体积1～5％的菌液，37℃培养至OD600为0.6～0.8；再加入IPTG至终浓度为0.1～0.8mol/L，23～28℃诱导表达3～4h，在10000～12000个重力加速度条件下离心沉淀菌体，收集菌体，将菌体进行超声波破碎，破碎后的菌体液于10000～12000个重力加速度条件下离心去除菌体碎片，收集离心分离出的上清液，得到环丁烷嘧啶二聚体光修复酶粗品；其中，超声波破碎的条件为：在200～400W的功率下，工作时间1～5s，间歇时间2?5s，超声破碎20?40min；b、环丁烷嘧啶二聚体光修复酶的纯化：将步骤a制得的环丁烷嘧啶二聚体光修复酶粗品以100～150ml/h的流速加入到谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱内，用5～10倍柱床体积的洗脱液A以200～400ml/h的流速进行淋洗，再以5～10倍柱床体积的洗脱液A和洗脱液B进行梯度洗脱，得到融合环丁烷嘧啶二聚体光修复酶；再按照1?5U/mg蛋白质的用量，将凝血酶加入到融合环丁烷嘧啶二聚体光修复酶中，37℃酶解1～3h，切除谷胱甘肽?S?转移酶，得到酶切水解液；将酶切水解液以100～150ml/h的流速加入到Q柱中，用5～10倍柱床体积的洗脱液C以200～400ml/h的流速进行淋洗，再以5～10倍柱床体积的洗脱液C和洗脱液D进行梯度洗脱，得到环丁烷嘧啶二聚体光修复酶；再将环丁烷嘧啶二聚体光修复酶进行脱盐柱脱盐处理，得到高纯度的环丁烷嘧啶二聚体光修复酶；其中，洗脱液A由50mM?Tris/HCl和0.15MNaCl组成；洗脱液B由50mM Tris/HCl和10mMGSH组成；洗脱液C由10mM?PB和0.15MNaCl组成；洗脱液D由10mM?PB和1MNaCl组成；c、环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备：称取50～100mg卵磷脂和20～50mg胆固醇，溶解于7.5～15ml乙醚中，加入0.1～0.5mg步骤b制得的高纯度环丁烷嘧啶二聚体光修复酶，再进行超声乳化，形成油包水，再进行蒸馏去除低沸点有机相，得到环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体混悬液；再继续蒸发，直至白色悬液形成；将白色悬液以15000?20000r/min离心30～40min，收集沉淀，冷冻保存，制得环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体。...
【技术特征摘要】
1.一种环丁烷嘧啶二聚体光修复酶脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: a、环丁烷嘧啶二聚体光修复酶的表达:从生物体中克隆到环丁烷嘧啶二聚体光修复酶基因，将该基因构建到原核表达载体P GEX4T-1中，再转化至大肠杆菌表达菌株E.coliBL21感受态细胞，得到菌液；在3 50ml含氨苄青霉素的LB培养基中加入LB培养基体积I 5%的菌液，37°C培养至OD6tltl为0.6 0.8 ;再加入IPTG至终浓度为0.1 0.8mol/L，23 28°C诱导表达3 4h，在10000 12000个重力加速度条件下离心沉淀菌体，收集菌体，将菌体进行超声波破碎，破碎后的菌体液于10000 12000个重力加速度条件下离心去除菌体碎片，收集离心分离出的上清液，得到环丁烷嘧啶二聚体光修复酶粗品；其中，超声波破碎的条件为:在200 400W的功率下，工作时间I 5s，间歇时间2-5s，超声破碎20-40min ； b、环丁烷嘧啶二聚体光修复酶的纯化:将步骤a制得的环丁烷嘧啶二聚体光修复酶粗品以100 150ml/h的流速加入到谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱内，用5 10倍柱床体积的洗脱液A以200 400ml/h的流速进行淋洗，再以5 10倍柱床体积的洗脱液A和洗脱液B进行梯度洗脱，得到融合环丁烷嘧啶二聚体光修复酶；再按照l_5U/mg蛋白质的用量，将凝血酶加入到融合环丁烷嘧啶二聚体光修复酶中，37°C酶解I 3h，切除谷胱甘肽-S-转移酶，得到酶切水解液...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹毅，乔代蓉，徐辉，
申请(专利权)人：曹毅，乔代蓉，徐辉，
类型：发明
国别省市：
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