扩增胰岛β细胞和使其再分化的方法技术

本发明专利技术提供了离体提高表达SLUG的祖细胞中的胰岛素含量的方法。该方法包括使祖细胞中的SLUG的量或活性下调。还提供了从而生成的细胞的群体和其用途。

Amplification of islet beta cells and methods of re differentiation

The present invention provides a method for in vitro enhancing insulin content in progenitor cells expressing SLUG. The method includes lowering the amount or activity of SLUG in progenitor cells. A group of cells thus generated and its use.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
和背景I型糖尿病是由于胰岛产胰岛素β细胞的自身免疫破坏所导致的。因为难以调整最佳胰岛素剂量，胰岛素施用不能阻止该疾病的长期并发症。用经调控的产胰岛素细胞替换损伤的细胞被认为是I型糖尿病的终极疗法。胰腺移植已获成功，但受供体缺乏的严重限制。随着新型胰岛分离和免疫抑制方法的发展，已报道了每个接受者利用来自2-3个供体的膜岛的显著成功(Shapiro AM, Lakey JR, Ryan EA 等人.New Engl J Med 2000 ；343:230-238)。该进展强调了开发人类胰腺供体的替代形式的迫切需要，即用于移植的培养的人类β细胞的丰富来源。终末分化的、有丝分裂期后的胰岛细胞难以在组织培养中扩增(expand)。将成体的和胎儿的人类胰岛细胞培养于含IlmM葡萄糖并补充有10% FBS和肝细胞生长因子的RPMI 1640培养基中的HTB-9基质上，其表现以最多10-15次群体倍增增殖，之后经历衰老。利用逆转录病毒将人类端粒酶(hTERT)的催化亚基导入到细胞中，其表达不能延长复制时间跨度(Halvorsen TL, Beattie GM, Lopez AD, Hayek A, Levine F.J Endocrinol 2000 ；166 =103-109)。由于大量的细胞死亡，该方法导致胰岛细胞团块的3-4次扩增。通过延长的培养进行β细胞扩增的过程伴有细胞的去分化。在许多情况下，细胞的去分化伴有表型的重大改变，其中其形态从含大量细胞-细胞连接和细胞角蛋白纤维网络的上皮细胞的形态变为具有成纤维细胞或间充质外观的细胞的形态。该去分化的过程称作上皮细胞-间充质细胞转变(EMT)，并认为其部分地受锌指转录因子Snail的诱导介导。Slug，是Snail家族成员，已参与皮肤创伤的再上皮化和损伤后受损的骨骼肌的再生。在胰腺干细胞的领域中，Gershengorn等人，提出了培养的原代β细胞能够EMT和 去分化为成纤维细胞样(fibroblastoid-like)的细胞类型。Gershengorn提出了该过程可被逆转，且这些成纤维细胞样细胞随后可通过所谓的间充质细胞-上皮细胞转变再分化为胰腺内分泌细胞。该文章发表后，Gershongorn收回了该说法并表明，经历分化的是存在于胰岛中的间充质干细胞而非去分化的β细胞。有丝分裂后的β细胞的被迫扩增的替代方式是诱导具有天然的自我扩增能力的干细胞/祖细胞分化成产胰岛素细胞。胚胎干细胞的定向分化已生成了与β细胞相比较仅产生少量胰岛素的细胞，且其在移植中的潜在用途遭遇伦理上的反对、以及有关畸胎瘤的风险的担心。还已将成体干细胞分化为产胰岛素细胞。然而，这些细胞类型在组织培养中的扩增效率和其分化为产胰岛素细胞的比率需要极大地提高以允许用于移植的大量细胞数目的产生。已清楚地证明，利用激活发育事件的级联反应的主要基因(dominant gene)可至少部分地使定型细胞重编程。本专利技术人的美国专利申请第20050244966号教导了通过导向内分泌胰腺发育的主要转录因子诸如Pdxl的表达，胎儿肝细胞重编程为β样产胰岛素细胞。诱导人类胎儿肝细胞大量地产生并贮存成熟的胰岛素，其中约三分之一由正常β细胞产生，响应于生理葡萄糖水平而释放，并在STZ-糖尿病非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷(NOD-scid)小鼠中替代细胞功能。该修饰的细胞表达多种细胞基因。已在表皮生长因子和神经生长因子的存在下离体(ex vivo)扩增了胰岛细胞。虽然这些细胞表现了高胰岛素含量，但它们不响应于葡萄糖分泌胰岛素(Lechner A.等人，Biochem Biophys Res Commun327:581-588,2005)。国际申请W02006/054305教导了在CMRL-1066培养基中扩增胰岛细胞。已显示大量的因子促进组织培养中的β -细胞增殖和分化二者。生长激素家族成员，包括胎盘催乳激素(PL)、生长激素(GH)和促乳素(PRL)，在新生大鼠胰岛细胞中诱导复制。已观察到肝细胞生长因子(HGF)对人类胎儿和成体胰岛以及小鼠胰岛的显著的促分裂效应。在激活素A或烟酰胺存在下，已显示HGF在培养的胎儿胰岛中以及胰腺细胞系中刺激β-细胞分化。已显示胰高血糖素样肽I (GLP-1)和其更稳定的类似物exendin-4在胰腺细胞系中刺激β_细胞增殖和诱导胰岛素基因表达。还已显示表皮生长因子(EGF)家族成员，包括EGF、TGFa和β细胞素(betacellulin)，刺激β-细胞增殖和分化。β细胞素对于包括胰岛β (β)细胞的多种细胞类型是有效的有丝分裂原。显示其可在阿脲和STZ处理的小鼠中增加胰岛素新生，并在90%胰腺切除术的大鼠中加速胰岛素再生。Rukstalis 等人教导了转录因子 Snail 在永生化的胰腺内分泌细胞系中调节激素表达。而且，公开了，在那些细胞系中利用siRNA使Snail下调提闻了膜岛素基因表达。美国专利申请第20060292127号教导了通过将细胞与调控转录因子Snail/slug/slit家族的剂相接触使β细胞去分化而不是再分化。国际申请W02006/054305教导了在含β细胞素和/或ngn_3的培养基中的扩增的β细胞的再分化。专利技术概沭根据本专利技术的一些实施方案的方面，提供了离体提高成体胰岛β细胞中胰岛素含量的方法，该方法包括将成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培养基，该培养基不含血清，从而提高成体胰岛β细胞中的胰岛素含量。离体提高表达SLUG的祖细胞中胰岛素含量的方法，所述方法包括使所述祖细胞中的所述SLUG的量或活性下调，从而提高所述祖细胞中的胰岛素含量。根据本专利技术的一些实施方案的方面，提供了细胞的分离的群体(isolatedpopulation of cells),其包含下调SLUG的siRNA,其中所述细胞分泌胰岛素。根据本专利技术的一些实施方案的方面，提供了根据本专利技术的方法生成的细胞的分离的群体。根据本专利技术的一些实施方案的方面，提供了在受治疗者中治疗糖尿病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本专利技术的成体胰岛β细胞的群体移植到受治疗者中，从而治疗糖尿病。根据本专利技术的一些实施方案的方面，提供了本专利技术的成体胰岛β细胞的群体在受治疗者中治疗糖尿病的应用。包含本专利技术的成体胰岛β细胞的群体作为活性成分的药物组合物。根据本专利技术的一些实施方案，方法包括:(a)将成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激动素A的培养基，其中葡萄糖以IO-1OOmM的浓度存在；和随后(b)将成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺和exendin-4的另外的培养基，其中葡萄糖以0.5-10mM的浓度存在。根据本专利技术的一些实施方案，烟酰胺以1-1OOmM的浓度存在。根据本专利技术的一些实施方案，exendin-4以1-1OOnM的浓度存在。根据本专利技术的一些实施方案，激动素A以1-1OOnM的浓度存在。根据本专利技术的一些实施方案，另外的培养基不含激动素A。根据本专利技术的一些实施方案，培养基不含β细胞素。根据本专利技术的一些实施方案，另外的培养基不含β细胞素。`根据本专利技术的一些实施方案，成体胰岛β细胞包括去分化的成体胰岛β细胞。根据本专利技术的一些实施方案，去分化的成体胰岛β细胞包括从β细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：西蒙·埃弗拉特，霍尔格·A·鲁斯，
申请(专利权)人：雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司，
类型：
国别省市：