一种达玛烯二醇的生物合成方法及其生产菌株技术

本发明专利技术涉及一种达玛烯二醇的生物合成方法，并提供了达玛烯二醇的生产菌株。本发明专利技术通过基因工程技术手段构建得到的毕赤酵母工程菌株，能高效重组表达达玛烯二醇合成酶，进而合成原人参二醇合成的前体物----达玛烯二醇，也为最终实现原人参二醇的生物合成及大规模工业化生产奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种达玛烯二醇的生物合成方法及其生产菌株。
技术介绍
几个世纪以来，天然产物尤其是高等植物的代谢产物一直是人类获得药物及其具有药理活性功能的活性物质的主要来源。世界上80%的人口主要依赖植物和植物提取成分维护生命和健康，天然药物及具有药理活性功能的天然产物在保障人类健康方面所发挥的作用愈加得到科学家的重视。原人参二醇属于植物三萜皂苷类化合物，是传统名贵药材人参和西洋参的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化作用，还具有广泛抗肿瘤的作用。然而作为原人参二醇的主要来源植物，人参、西洋 参需要4到15年的生长栽培阶段，生产上由于连作障碍和病虫害的困扰，品质及其生长环境受到严重限制；同时人参、西洋参等中具有独特药理活性的原人参二醇含量稀少，抗癌成分含量甚微。总之，原人参二醇的天然获得存在着生长周期长，原材料含量低，提取技术复杂，纯度较低等困境。原人参二醇的人工合成是生物、化学和医药界长期关注和研究的领域。但由于这类化合物化学结构复杂，骨架上有多个手性结构，迄今为止，尚不能通过化学方法合成。近年来，通过基因工程手段在微生物中合成原人参二醇逐渐受到人们的关注。达玛烯二醇(Da_arenediol-1I)是原人参二醇合成的前体物，可衍生出原人参二醇。本专利技术人通过基因工程手段构建重组菌株，用以生产达玛烯二醇。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种达玛烯二醇的生物合成方法，并提供用于生产达玛烯二醇的重组菌株。本专利技术设计思路和原理为:达玛烯二醇由2，3-环氧角藍烯(2,3-oxidosqualene)在达玛烯二醇合成酶(Dammarenediol-1I synthase,简称DS)的催化下合成。与其他微生物相比，毕赤酵母(Pichia.pastoris)生长快、安全性高，且为模式生物,其代谢调控研究得比较清楚，特别是发现毕赤酵母自身能够合成达玛烯二醇的前体2，3-氧化角鲨烯，因此本专利技术人选用毕赤酵母作为合成达玛烯二醇的异源表达宿主。本专利技术提供了一种用于制备达玛烯二醇的重组毕赤酵母工程菌，该重组毕赤酵母工程菌携带有含达玛烯二醇合成酶编码基因的表达载体。本专利技术中，所述的达玛烯二醇合成酶编码基因具有:Ca)包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或者(b)与SEQ ID NO:1具有95%序列同一性的核苷酸序列。本专利技术的一个优选实施方案中，携带有含达玛烯二醇合成酶编码基因的表达载体为质粒pPICZa。本专利技术的一个优选实施方案中，所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母工程菌株GS-115。另一方面，本专利技术提供了另一种用于制备达玛烯二醇的重组毕赤酵母工程菌，该毕赤酵母工程菌携带有含达玛烯二醇合成酶基因的表达载体和含2，3-环氧角鲨烯合成酶编码基因的表达载体。本专利技术中，所述的达玛烯二醇合成酶编码基因具有:Ca)包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO:具有95%序列同一性的核苷酸序列。本专利技术中，所述的2，3_环氧角鲨烯合成酶编码基因具有:(a)包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO:具有95%序列同一性的核苷酸序列。本专利技术的一个优选实施方案中，所述的含达玛烯二醇合成酶基因的表达载体为质粒 pPicZa。本专利技术的一个优选实施方案中，所述的含2，3_环氧角鲨烯合成酶编码基因的表达载体为质粒Ppic9k。本专利技术的一个优选实施方案中，所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母工程菌株GS-115。另一方面，本专利技术提供了一种生物合成达玛烯二醇的方法，该方法包括:(I)发酵培养本专利技术所述重组毕赤酵母工程菌；(2)收集发酵液，获取达玛烯二醇。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述发酵培养的具体操作为:在BMMY发酵培养基中30°C，200rpm，发酵培养，每隔24h加0.5%的甲醇诱导。所述获取达玛烯二醇的具体操作为:取发酵液，离心收集菌体，加入10ml20%Na0H乙醇溶液破碎，破碎30min，IOml正己烷混匀，室温静置lOmin，取上清浓缩。本专利技术的有益效果本专利技术利用基因工程技术手段，实现了达玛烯二醇的生物合成。利用本专利技术的重组工程菌能提高达玛烯二醇的产量，降低生产成本，为原人参二醇的大规模工业化生产奠定了基础。附图说明:图1:DS_pPicZa 质粒图谱图2:GS115-DS菌体胞内蛋白SDS-PAGE电泳检测图其中:泳道I 为GS115_pPic9k (阴性对照)菌体胞内蛋白；泳道2为GS115-DS菌体胞内蛋白。箭头所指为达玛烯二醇合成酶。图3:GS115-DS菌体胞内代谢产物TLC分析图谱其中:泳道I为GS115_Ppic9k胞内代谢产物；泳道2，3为GS115-DS胞内代谢产物；泳道4为达玛烯二醇标准品。箭头所指为达玛烯二醇。图4:MS质谱分析图谱其中:A为空白溶剂乙腈质谱分析(阴性对照)；B为达玛烯二醇标准品质谱分析；C为GS115-DS菌体胞内目标产物质谱分析。图中框出的部分图谱表明产物为达玛烯二醇。图5:GS115-DS-SS菌体胞内合成产物TLC分析图谱其中:泳道1为65115- 化91^菌体胞内合成产物；泳道2为GS115-SS菌体胞内合成产物；泳道5为达玛烯二醇标准品；泳道3，4，6，7，8，9分别为经甲醇诱导24h、48h、72h、96h、120h、144h后的GS115-DS-SS菌体胞内合成产物。箭头所指为达玛烯二醇。具体实施例下面结合实例对本专利技术的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本专利技术。但是，本专利技术的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。 实例中所用毕赤酵母GS115工程菌株,及其表达质粒均购自invrogen公司。实例中所用Cycle-pure试剂盒，Plasmid试剂盒，Gel Extraction试剂盒均购自OMEGA公司。限制性内切酶购自上海宝生Takara公司。实施例1达玛烯二醇合成酶表达载体的构建将人参基因组中达玛烯二醇合成酶基因GenBank:AB265170.1依据毕赤酵母GS115密码偏爱进行密码子优化，优化后的达玛烯二醇合成酶基因序列为SEQ ID N0:1，该基因由上海青兰生物科技有限公司合成。设计基因片段两端酶切位点AsuII和Xbal。分别利用引物F:5’ -TACTTCGAAATGGCCTGGAAGCAAAAAGGTGCTC-3’ 和 R:5 ’ -GCCTCTAGATTAAATTTTCAACTGCTGATGTTAG-3 ’ 进行 PCR 扩增，PCR 扩增条件:940C，5min ；94°C，30S, 58°C，30S, 30 个循环；72°C, 2.5min ；72°C，IOmin0将PCR扩增产物与毕赤酵母表达质粒pPicZa (购自Invitrogen公司),经AsuII和XbaI双酶切，37°C酶切过夜后，酶切产物琼脂糖胶回收纯化。以酶切PCR产物与酶切线性化质粒PPicZa摩尔浓度10:1的设计连接体系，加入0.5ul T4连接酶，16°C连接过夜，将连接产物加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备达玛烯二醇的重组毕赤酵母工程菌，该重组毕赤酵母工程菌携带有含达玛烯二醇合成酶编码基因的表达载体。

【技术特征摘要】
1.一种用于制备达玛烯二醇的重组毕赤酵母工程菌，该重组毕赤酵母工程菌携带有含达玛烯二醇合成酶编码基因的表达载体。2.权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的达玛烯二醇合成酶编码基因具有: (a)包含SEQID NO:1所示的核苷酸序列；或者 (b)与SEQID NO:具有95%序列同一性的核苷酸序列。3.权利要求1或2所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母工程菌株GS-115。4.一种用于制备达玛烯二醇的重组毕赤酵母工程菌，该重组毕赤酵母工程菌携带有含达玛烯二醇合成酶基因的表达载体和含2，3-环氧角鲨烯合成酶编码基因的表达载体。5.权利要求4所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的达玛烯二醇合成酶编码基因具有: (a)包含SEQID NO:1所示的核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华明，黄涛，原静，黄亦钧，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：