全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体及其制备方法和应用，该Fab抗体是按照如下方法制备而成：从丙型肝炎感染患者中分离淋巴细胞，并通过噬菌体展示技术分离全人源抗丙型肝炎核心抗原的抗体基因，采用Fab抗体基因表达方法，表达并分离得到相应的抗体蛋白，其可用于丙肝炎核心抗原的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因重组抗体药物
，具体而言，涉及全人源基因重组Fab抗体，尤其涉及特异地针对丙型肝炎核心抗原的基因工程Fab抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
丙型肝炎病毒(Hepatitis Virus C type, HCV)是一种能够引起人类非甲非乙型肝炎的RNA病毒，其主要经血液途径传播，据统计目前全世界约有1.7亿HCV的感染者，我国的丙型肝炎感染者已经超过4000万。目前还没有针对HCV的有效疫苗用以预防丙型肝炎的传播，因此为防止医源性 的丙型肝炎的传染，HCV感染的诊断和血液制品生产相关领域的筛查，对于阻止HCV的传播具有重要的意义。目前，国内外针对丙型肝炎的诊断试剂盒分为两种，一种是检测病人血液或其它样品中存在的HCV病毒基因组，而采用RT-PCR方法进行定量检测；另一种则采用免疫学方法检测样品中的HCV相关的抗原和或抗体。针对抗HCV病毒相关的抗体类试剂盒在检测HCV感染的“窗口期”约70-80天；而针对HCV核心抗原的，用抗HCV核心抗原的单抗的双抗体夹心法检测样品中存在的HCV核心抗原，使检测HCV感染的“窗口期”提高至14天，但两种试剂盒均各有优缺点。单克隆抗体技术、基因重组抗体技术已经是比较成熟的技术，并且通过杂交瘤技术已经制备了多种针对HCV的单克隆抗体。也有采用噬菌体展示技术，构建了针对HCV的抗体库。我们通过噬菌体技术从HCV感染者中分离外周血单个核细胞，建立了相应的抗HCV抗体展示库，并从该库中筛选到能够与HCV核心抗原具有高亲和力的噬菌体颗粒，并通过基因克隆技术获得相应的抗体基因，采用全人源抗体基因工程表达技术，在大肠杆菌中实现全人源Fab抗体的表达。利用本方法制备的Fab抗体可能作为HCV诊断试剂盒的组分用于诊断试剂盒的开发，并且该Fab抗体可能具有治疗HCV的潜在价值。
技术实现思路
本专利技术通过基因重组技术，克隆抗HCV核心抗原的抗体基因，表达并分离纯化全人源抗HCV核心抗原的基因工程Fab抗体，并将该抗体用于研制HCV诊断试剂盒，尤其是用于早期复查HCV感染的HCV核心抗原的检测。因此，本专利技术的目的在于提供一种全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体及其制备方法和应用、编码该Fab抗体的DNA分子、包含该DNA分子的表达载体，以及被该表达载体转化的原核宿主细胞。本专利技术的目的是这样实现的:一种全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其中:(I)重链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；(2)轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。一种DNA分子，编码上述的基因工程Fab抗体的重链或/和轻链。在本专利技术的一个较佳的实施例中，上述的DNA分子编码所述基因工程Fab抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所示，以及编码所述基因工程Fab抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8所示。一种表达载体，包含有上述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。一种原核宿主细胞，它被上述的表达载体转化。优选地，所述的原核宿主细胞是大肠杆菌。进一步优选地，所述的原核宿主细胞是大肠杆菌BL21。上述的基因工程Fab抗体可以用于制备诊断、预防和/或治疗丙型肝炎病的试剂或药物。一种制备上述的基因工程Fab抗体的方法，包括如下步骤:(I)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求2所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列；(2)用步骤(I)所述的表达载体转化原核宿主细胞；(3)在适合所述的基因工程Fab抗体表达的条件下培养步骤(2)所得的原核宿主细胞；(4)分离纯化获 得所述的基因工程Fab抗体。上述的制备方法，其中所述的表达载体为分泌型表达载体，该分泌型表达载体能在分泌信号引导下使所述基因工程Fab抗体的多肽链被分泌到原核宿主细胞周质中。与现有技术相比，本专利技术涉及的基因工程Fab抗体及其制备方法具有如下优点和显著的进步:(I)采用从感染者淋巴细胞中分离抗体基因的方法获得一种全人源的抗体基因序列，并采用基因工程技术表达FAB抗体技术，获得的一组全人源的基因工程FAB抗体；(2)通过体外组合的方法，获得的FAB抗体具有双识别的特性。附图说明图1抗体重链基因PCR克隆(以pMD-VHl为例)图2FAB抗体基因表达载体pFAB_VHl的构建图3FAB抗体基因表达载体pFAB_VH2的构建图4FAB抗体基因表达载体pFAB_VKl的构建图5FAB抗体基因表达载体pFAB_VK2的构建图6分泌FAB抗体基因表达载体pFAB_pelB_VHlCH的构建图7分泌FAB抗体基因表达载体pFAB_pelB_VH2CH的构建图8分泌FAB抗体基因表达载体pFAB_pelB_VKlCK的构建图9分泌FAB抗体基因表达载体pFAB_pelB_VK2CK的构建图10分泌成熟FAB抗体表达载体pFAB_pelB-VHlCH-VKlCK的构建图11分泌成熟FAB抗体表达载体pFAB_pelB-VH2CH_VKlCK的构建图12分泌成熟FAB抗体表达载体pFAB_pelB-VHlCH_VK2CK的构建图13分泌成熟FAB抗体表达载体pFAB_pelB-VH2CH_VK2CK的构建。具体实施例方式本专利技术涉及的基因工程Fab抗体的制备包括如下步骤:1、采用HCV感染病人，经过诊断是抗HCV核心抗原抗体阳性的患者，从一病人中分离出外周血单个核细胞，采用常规分子生物学技术，分离细胞总RNA，反转录出cDNA，并用针对抗体基因重链可变区和轻链可变区基因的通用引物进行扩增，扩增产物经电泳分离并胶回收相应的特异扩增基因产物，经过双酶切并与同样酶切的PC0MB3，连接并转化大肠杆菌，并在辅助噬菌体作用下，建立相应的噬菌体展示库。2、将重组人HCV核心抗原包被到酶标板上，将上述噬菌体展示库经过四轮淘洗筛选，获得表达具有抗HCV核心抗原高亲和力的噬菌粒。经过转化、扩增、提取噬菌体DNA，将阳性克隆进行测序并分析抗体可变区基因序列及编码氨基酸。共选择具有较高亲和力的两个阳性克隆，对它们的轻链和重链分别进行序列分析，结果为重链可变区核苷酸序列如SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8所示。其对应的重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO: 2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4所示。3、设计与Fab抗体表达载体pFABs相匹配的带相应酶切位点的针对前述各个抗体重链和轻链基因引物，PCR,以阳性噬菌粒为模板，扩增各个基因片段，并亚克隆到pMD-18 (TaKRa，Inc)载体中，分别得到各个基因重组质粒，标记为pMD_VHl、pMD_VH2、pMD-VKl 和 pMD-VK2 (参见图1)。4、按设计的限制性内切酶位点，进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于：（1）重链可变区氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；（2）轻链可变区氨基酸序列如SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：娄永华，
申请(专利权)人：浙江家和制药有限公司，
类型：发明
国别省市：