本发明专利技术属于动物免疫分析技术领域。具体涉及一种用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测的酶联免疫(ELISA)试剂盒及应用。本发明专利技术的方法主要包括免疫原、抗体的制备、包被原及酶标抗体的制备和ELISA检测方法的建立。本发明专利技术的试剂盒主要由抗PRRSVN蛋白特异性酶标记物、PRRSV标准阳性对照、包被有抗PRRSVN蛋白特异性单克隆抗体的酶标板组成。本发明专利技术的试剂盒具有简便、快速、灵敏、准确等特点，适用于对临床猪群中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测。
【技术实现步骤摘要】
—种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒及应用
本专利技术属于动物免疫化学分析
具体涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的酶联免疫(ELISA)检测试剂盒与应用，本专利技术的试剂盒适用于临床猪群的猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductive and respiratory syndrome,简称 PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，简称PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的烈性传染病。以妊娠母猪流产、死产、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍及各年龄阶段猪的呼吸道症状为特征。1987年首次在美国发现，当时由于病原不清楚，故称为“猪神秘病”，又因为部分发病猪耳部发绀变紫，故又称之为“蓝耳病”。不久PRRS迅速在北美和欧洲暴发流行。1995年国内某些猪场发生了以流产、死胎等为主要症状的疫病，怀疑是由PRRSV引起的繁殖障碍性疾病。1996年中国农科院哈尔滨兽医研究所在国内分离到第一株PRRSV病毒(CH-1a株)，证实该病在国内存在。2006年6 月开始，我国南方部分省市发生了以体温高热不退、皮肤发红、呼吸困难为主要临床症状的疫情，该病给养猪业造成了巨大经济损失。经流行病学调查、病毒分离、基因分析、动物试验等，最终确定是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株造成的，并定名为高致病性猪蓝耳病。目前检测PRRSV抗原的主要方法有RT-PCR、免疫过氧化物酶单层试验 (Immunoperoxidase monolayer assay, IPMA)和病毒分离等。检测 PRRSV 抗体的方主要是血清学实验，包括 IPMA、间接免疫突光(indirect immunofluorescence assay, IFA)、 血清中和试验(serum neutralization test, SN)和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)。IPMA需要首先分离出病毒,而分离病毒所需时间长，且灵敏性差。国内外有部分学者采用RT-PCR技术检测PRRS病原的存在，并获得了较好的实验室检测效果，然而RT-PCR首先需要反转录，其技术要求高、样本处理难、价格昂贵，因此不适用于大规模检测。我国现阶段缺乏快速、准确、成本低廉的PRRS检测试剂。近年来，ELISA 法以其灵敏、快速、特异、简便等优点，在动物疾病的检测诊断领域已被广泛应用。目前国内外检测PRRSV抗原的ELISA方法较多，但已申请专利的检测PRRSV抗原的ELISA方法只有两种，分别是杨汉舂等的“猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心ELISA试剂盒”(专利申请号200910093631.1)和吴艳涛等的“检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒及检测方法”(专利申请号201010252436.1)。与上述两个专利相比本专利技术是采用针对高致病性PRRSVN蛋白不同抗原表位的两株单克隆抗体建立的双抗体夹心ELISA方法，而吴艳涛等采用的是一株针对PRRSV N蛋白的单克隆抗体和一种针对整个PRRSV的多克隆抗体，在方法的建立方面有本质的不同；杨汉春等采用的是针对PRRSV经典株-BJ-4株的单克隆抗体。 但 是，目前在我国流行的主要是高致病性PRRSV，本专利中请在对高致病性PRRSV进行检测时具有更高的特异性。本专利技术应用免疫学技术筛选出针对PRRSVN蛋白单克隆抗体，研制针对高致病性 PRRSV的快速检测试剂盒，并对其性能进行测定。试剂盒检测方位宽，假阳性低，检测灵敏、 准确、可靠，适用于临床猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，制备专门针对抗PRRSV WUH3株N蛋白单克隆抗体。利用2株针对N蛋白不同抗原表位的单克隆抗体研制一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒，作为在临床猪群中的猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA 检测方法中的应用。本专利技术的技术方案是申请人通过分子生物学方法，获得一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体，该抗体是由保藏号为CCTCC NO C201195和保藏号为CCTCC NO C201194的杂交瘤细胞N4D2和N3H12所分泌的。所述的杂交瘤细胞N4D2和N3H12于2011年9月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号分别为CCTCC NO :C201195和CCTCC NO C201194o申请人研制了一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其包含所述的保藏号为CCTCCNO C201195和保藏号为CCTCC NO C201194的杂交瘤细胞N4D2和N3H12 所分泌的的单克隆抗体。申请人提供了一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的的ELISA试剂盒，该试剂盒由下列部分构成保藏号为CCTCC NO C201195的单克隆抗体包被的酶标板和保藏号为CCTCC NO C201194的单克隆抗体制备的酶标记物，阳性对照，阴性对照，包被液，洗涤液，样品稀释液，底物显色液A、底物显色液B和终止液，其中所述的包被液，洗涤液，样品稀释液，底物显色液A、底物显色液B和终止液的组分及配比如下包被液为O. 05mol/L pH9. 6的碳酸盐缓冲液1. 59gNa2C03，2. 93gNaHC03，加三蒸水定容至IOOOmL ；20 倍浓缩洗涤液称取 NaCI 160g、KCl 4g、Na2HPO4 · 12H20 58g、KH2P044g,用 800ml三蒸水溶解，调节pH值至7. 4，再加入Tween-2010ml，最后加三蒸水定容至IOOOml ；封闭液在IOOml洗涤液中加入5g脱脂乳溶解制成；底物显色液A =Na2HPO4 · 12H20 14. 6g，柠檬酸9. 33g，过氧化氢脲O. 52g，加注射用水溶解并定容至1000ml，调pH至5. O 5. 4，用O. 22 μ m滤膜过滤除菌，无菌分装；IOml/ 瓶；底物显色液B :四甲基联苯二胺20mg,无水乙醇IOml,加注射用水溶解并定容至 IOOOml ;过滤除菌，无菌分装，IOml/瓶； 终止液2. 5ml氢氟酸加到900ml注射用水中，定容至1000ml,过滤除菌；无菌分装；10ml/ 瓶。本专利技术是通过如下步骤获得的一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA检测方法，其包括制备免疫原、抗体、包被原、酶标板、酶标记物和样品前处理，其具体制备步骤如下所述(I)将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)WUH3株0RF7基因扩增后，连接到 pET-30a载体上，构建原核表达质粒pET-30a-0RF7，转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)后，将其表达产物(重组的N蛋白)经N1-NTA柱纯化后得到免疫原；(2)将步骤⑴得到的重组N蛋白免疫原经动物免疫、细胞融合和筛选后得到特异性抗N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞N4D2和N3H12(其保藏号分别为CCTCC NO C201195 和 CCTCC NO C201194)；(3)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCC?NO：C201195和保藏号为CCTCC?NO：C201194的杂交瘤细胞N4D2和N3H12所分泌的。
【技术特征摘要】
1.一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCC NO C201195和保藏号为CCTCC NO C201194的杂交瘤细胞N4D2和N3H12所分泌的。2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号分别为 CCTCC NO C201195 和 CCTCC NO :C201194。3.—种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其包含权利要求1所述的单克隆抗体。4.一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的的ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒由下列部分构成保藏号为CCTCC NO C201195的单克隆抗体包被的酶标板和保藏号为CCTCC NO C201194的单克隆抗体制备的酶标记物，阳性对照，阴性对照，包被液，洗涤液，样品稀释液，底物显色液A、底物显色液B和终止液，其中所述的包被液，洗涤液，样品稀释液，底物显色液A、底物显色液B和终止液的组分及配比如下 包被液为0.05mol/L ρΗ9·6的碳酸盐缓冲液1.59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3，加三蒸水定容至 IOOOmL ； 20 倍浓缩洗涤液称取 NaCl 160g、KCl 4g、Na2HPO4 · 12H20 58g、KH2P044g，用 800ml 三蒸水溶解，调节pH至7. 4,再加入Tween-2010ml,最后加三蒸水定容至IOOOml ； 封闭液在IOOml洗涤液中加入5g脱脂乳溶解制成； 底物显色液A =Na2HPO4 · 12H20 14. 6g，柠檬酸9. 33g，过氧化氢脲O. 52g，加注射用水溶解并定容至1000ml...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖少波，方六荣，朱海波，宋涛，曾松林，张玉娟，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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