本发明专利技术涉及blaKPC基因检测试剂盒，特别是涉及一种利用复合探针技术实时荧光PCR技术检测肺炎克雷伯菌KPC型碳青霉烯酶(blaKPC)基因的试剂盒。该试剂盒通过对样本中的blaKPC基因进行定性检测，可广泛应用于含blaKPC基因细菌感染的辅助诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及blaKPC基因检测试剂盒，特别是涉及一种利用复合探针技术实时荧光PCR技术检测肺炎克雷伯菌KPC型碳青霉烯酶基因(blaKPC基因)的试剂盒。该试剂盒通过对样本中的blaKPC基因进行定性检测，可广泛应用于含blaKPC基因细菌感染的辅助诊断。
技术介绍
肺炎克雷伯菌是引起医院感染和社区感染的条件致病菌之一。碳青霉烯类抗菌药物是治疗包括产超广谱内酰胺酶(ESBLs)在内的肺炎克雷伯菌所致严重感染的强有力武器。但是，随着碳青霉烯类抗菌药物在临床上的大量使用，出现了不同的耐药菌株如铜绿假单胞菌和不动杆菌属细菌。2001年，自Yig it等在肺炎克雷伯菌中发现了一种新型的非金属碳青霉烯酶并命名为KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemase, KPC)以来，仅仅几年时间，KPC酶已在美国，特别是在美国的东北部各州蔓延，在局部造成暴发和流行，而且在肠杆菌的多个菌属中都有报道，包括肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、产酸克雷伯菌、沙门菌，主要为质粒介导；目前，产KPC的在菌株中国、以色列、希腊、哥伦比亚、巴西、英国、挪威及瑞典等国家均已发现。[Yigit H, Queenan AM, Anders on GJ, e t al.Novelcarbapenem-hydrolyzing beta-lactamase， KPC-1， from a carbapenem-resistantstrain of Klebsiella pneumoniae.Antimicrob Agents Chemother,2001,45 (4):1151-1161 ；Mendes RE，Bell JM, T urnidge JD, et al.Carbapenem-resistantisolates of Klebsiella pneumoniae in China and detection of a conjugativeplasmid (blaKPC_2plus qnrB4)and a blaIMP-4gene.Antimicrob Agents Chemother,2008,52 (2):798-799 ;Samuelsen，Naseer U，Tofteland S，et al.Emergence ofclonally related Klebsiella pneumoniae isolates of sequence type258producingplasmid-mediated KPC ca rbapenemase in Norway and Sweden.J Antimicrob Chemother,2009,63(4):654-658]。目前认为KPC型碳青霉烯酶基因是引起肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因，KPC型碳青霉烯酶是一种丝氨酸￠-内酰胺酶，几乎能水解所有￠-内酰胺类抗生素，包括头孢菌素类、青霉素类、碳青霉烯类，KPC酶基因位于可移动的质粒上，可以通过质粒或插入序列进行水平传播。目前所报道的KPC酶分为I 4型，其中KPCl位于一个非接合性质粒上，KPC2、3都位于接合性质粒上。对目前所报道的相关文献进行统计和分类发现，世界各地与中国地区均以KPC2型报道较多。Naas等报道在产KPC酶的肺炎克雷伯菌中，KPC酶基因位于Tn4401转座子上，左右各有一个插入序列，KPC编码基因很可能依靠两边的插入序列随着转座子在不同的菌种中快速传播。[Bratu S, Landam D, Haag R,et al.Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella pneum oniae in New YorkCity:a new threat to our antibiotic armamentarium.Arch Intern Med，2005，165:1430-1435 ；Smith Moland E,Hanson ND,Herrera VL,et al.Plasmid-mediated carbapenem—hydrolyzing旦-lactamase,KPC—2,in Klebsiella pneumoniae isolates.J AntimicrobChemother，2003，51(3):711-714;Naas T, Nordnann D,Vedel G，et al.Plasmid-mediatedcarbapenem—hydrolyzing旦-lactamase KPC in a Klebsiella pneumoniae isolate fromFrance.Antimicrob Agents Chemother,2005,49(10):4423-4424]。临床微生物实验室对产KPC酶菌株的检测较为困难，主要原因包括:1)产KPC-2型碳青霉烯酶的菌株既可表现为对碳青霉烯类抗生素耐药，也可表现为低敏感性；2)存在接种效应，会出现假敏现象；3)产KPC酶的菌株用ESBLs确证试验检测可能为阳性，容易造成误判；4)产KPC酶的菌株往往同时产其它￠-内酰胺酶，产生多重耐药，容易导致误检。现将目前临床上检测KPC酶肺炎克雷伯菌的主要方法分述如下: 1.通过液体培养基和纸片扩散法检测抗菌素敏感性，这类方法由于￠-内酰胺类抗生素抗性的异质表达而容易产生假敏现象。2.琼脂扩散法:在检测KPC酶介导的耐药性时，厄他培南比单独的美罗培南、亚安培南敏感性更强，因此似乎厄他培南是检测产KPC肠杆菌属的最佳分子；然而，由于厄他培南抗性本身并不是KPC表达的标志物，因为其他因素如ESBL和AmpC也会引起厄他培南抗性，因此这类方法也有很大的局限性。3.分子诊断方法:通过分子诊断方法检测产KPC菌株正逐渐成为金标准。其中，实时荧光PCR法则是公认的检测细菌最准确、最快捷的方法。目前也有数种基于PCR末端和实时检测技术被用于产KPC菌株的检测，这些技术具有更高的特异性，但需要专业的技术人员和设备才能实施，检测成本相对也较高。本试验以blaKPC基因为靶序列，应用复合探针法建立了一种特异、灵敏、快速检测产KPC酶细菌的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种实时荧光PCR法检测blaKPC基因的试剂盒(下面简称试剂盒)，该试剂盒包括:(I)样本处理液、PCR反应液A、PCR反应液B、阴性对照、强阳对照、临界阳性对照各内标。(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。为了解决上述任务，本专利技术的具体技术路线为:(I)针对blaKPC基因保守序列设计的能够与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针。(2)寡核苷酸探针标记荧光发生基团，使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多聚核苷酸间接结合。(3)适宜于PCR扩增的反应体系和荧光检测体系。核酸扩增反应体系包括耐热DNA聚合酶、2’ -脱氧核苷三磷酸、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、含有镁离子和甲酰胺的缓冲液。(4)从待测样本中提取D本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种实时荧光PCR法检测肺炎克雷伯菌KPC型碳青霉烯酶(blaKPC)基因的试剂盒(下面简称试剂盒)，该试剂盒包括：(1)样本处理液、PCR反应液A、PCR反应液B、阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照和内标；(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中试剂盒的PCR反应液由2×PCR缓冲液、靶基因和内标的正向引物、反向引物、寡核苷酸探针和灭菌水组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别是5’?CTGGGCAGTCGGAGACAAAA?3’和5’?AGACGGCCAACACAATAGGT?3’监测体系的内标引物分别是5’?ACCCTATTTTCATTCTTCGCC?3’和5’?GGTATCCAGATCCACAACCTT?3’。
【技术特征摘要】
1.一种实时荧光PCR法检测肺炎克雷伯菌KPC型碳青霉烯酶(blaKPC)基因的试剂盒(下面简称试剂盒)，该试剂盒包括:(I)样本处理液、PCR反应液A、PCR反应液B、阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照和内标；(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中试剂盒的PCR反应液由2 XPCR缓冲液、靶基因和内标的正向引物、反向引物、寡核苷酸探针和灭菌水组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别是5’ -CTGGGCAGTCGGAGACAAAA-3’ 和 5’ -AGACGGCCAACACAATAGGT-3’ 监测体系的内标引物分别是 5， -ACCCTATTTTCATTCTTCGCC-3，和 5，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王升启，陈苏红，吕虹，刘志红，孙晓彦，刘琦琪，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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