一种昆虫翅盘异常发育基因片段及其dsRNA和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种昆虫翅盘异常发育基因片段及其dsRNA和应用。本发明专利技术的昆虫翅盘异常发育基因片段的核苷酸序列是SEQ?ID?NO：1，以其为模板合成的dsRNA能够用于致死害虫。本发明专利技术通过人工合成斜纹夜蛾AWD基因片段的dsRNA沉默AWD基因，使蛹期斜纹夜蛾致死或使其成虫的翅发育畸形。将斜纹夜蛾AWD基因极高的特异性作为害虫控制的靶标防治害虫，对环境生态安全和食品安全没有任何影响，同时，有效避免产生严重的抗性问题。本发明专利技术为以该基因序列为靶标的新型生物杀虫剂的研发提供分子生物学技术，有利于鳞翅目食叶性害虫综合治理体系的建立。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物领域，具体涉及一种昆虫翅盘异常发育基因片段及其dsRNA和dsRNA致死害虫的应用。
技术介绍
害虫危害极大地制约了我国农作物产量和质量的提高，目前控制害虫的主要手段是施用化学杀虫剂，但是大量施用化学杀虫剂会导致一系列问题，诸如:1)害虫抗药性增强，防治成本提高；2)农药残留引起一系列环境污染和食品安全问题；3)破坏生态平衡，对非靶标生物有较大的影响。现有的生物防治方法如生物杀虫剂等作用时间长且起效慢，而敲除害虫生长发育的特异性基因的方法是将来害虫综合治理的发展趋势之一。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指外源或内源的双链RNA(double2stranded RNA, dsRNA)特异性地引起基因表达沉默的现象。它具有稳定转座子、清除异常RNA、调节基因表达等功能，且RNAi沉默基因的高效率、高特异性以及能在细胞内进行人工诱导，使RNAi作为一种反向遗传技术广泛应用于基因功能的研究。RNAi—直广泛应用于基因功能的研究，在利用该技术成功鉴定了多种昆虫基因功能的同时，科学家们试图将该技术应用于害虫防治领域，目前已在鳞翅目和鞘翅目昆虫中试验成功。通过对棉铃虫幼虫饲喂表达P450基因(CYP6AE14))和谷胱甘肽基因GSTldsRNA的棉花，诱导RNAi并阻碍了幼虫发育，这一技术为田间害虫控制开辟了新领域(Mao etal.,2007);采用RNA干扰技术，开展翅盘异常发育基因dsRNA在害虫防治中的应用具有重要的意义。相比于传统的害虫控制策略，害虫基因沉默控制的优势在于:(I)根据害虫基因序列的特异性，可以设计使目的基因 沉默的专一性基因，同时由于RNA分子的不稳定性，不会出现残留污染问题，因此对环境生态安全和食品安全没有任何影响；(2)防治对象的特异性极高，不会对其他昆虫特别是害虫天敌产生负面影响，有利于害虫生物防治和综合治理体系的实施；(3)对由于基因突变产生的抗性问题，很容易通过改变小RNA的序列来解决，以变制变，因此不会产生严重的抗性问题。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种昆虫翅盘异常发育基因片段。本专利技术的另一目的在于提供上述的昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA。本专利技术的再一目的在于提供上述的昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA的用途。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种昆虫翅盘异常发育基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO:1。上述的昆虫翅盘异常发育基因片段(SEQ ID NO:1 )，是根据NCBI数据库设计上游引物(序列如SEQ ID NO:2所示)和下游引物(序列如SEQ ID NO:3所示)，通过PCR扩增获得 SEQ ID NO:lo一种昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA，是以上述的昆虫翅盘异常发育基因片段(SEQ ID NO:1)为模板，通过试剂盒合成。上述的昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA可以用于致死害虫，即将dsRNA注射到昆虫体腔。实验结果表明:上述的昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA可以特异性地沉默昆虫体内翅盘异常发育基因的mRNA表达，使昆虫在蜕皮化蛹和羽化过程中死亡。在RNAi过程中，只有导入到生物体内的dsRNA被Dicer酶切割成siRNA后才能发挥作用。一般而言，具有功能性的siRNA分子其最小剪辑长度为19bp。即设计的能够沉默目标基因的dsRNA与这个物种之中的其他基因相比，没有连续19bp以上的碱基完全相同，那么就能保证降低特异性目的片段的转录水平。但是，如果设计的dsRNA是针对同一物种的很多基因共有保守序列，特别是对具有大于19bp以上完全相同的连续碱基的两个或多个目标基因，那么则有可能会导致目标基因的“脱靶效应”。根据上述理论，我们就可以利用“脱靶效应”沉默一个基因家族的多个基因或不同物种的同类基因。本专利技术根据上述dsRNA设计的基本原则，在斜纹夜蛾AWD mRNA序列(即JF690666)上选取了 537bp的片段作为dsRNA的表达区域，通过序列分析和单一性检测没有发现连续19bp以上碱基序列完全相同的基因，因此确定该序列可以作为靶标基因序列。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果:本专利技术通过人工合成斜纹夜蛾AWD基因片段的dsRNA沉默AWD基因，使蛹期斜纹夜蛾致死或使其成虫的翅发育畸形。将斜纹夜蛾AWD基因极高的特异性作为害虫控制的靶标防治害虫，对环境生态安全和食品安全没有任何影响，同时，有效避免产生严重的抗性问题。本专利技术为以该基因序列为靶标的新型生物杀虫剂的研发提供分子生物学技术，有利于鳞翅目食叶性害虫综合治理体系的建立。 相比于传统的害虫控制策略，害虫基因沉默控制的优势在于:(I)根据害虫基因序列的特异性，可以设计使目的基因沉默的专一性基因，同时由于RNA分子的不稳定性，不会出现残留污染问题，因此对环境生态安全和食品安全没有任何影响；(2)防治对象的特异性极高，不会对其他昆虫特别是害虫天敌产生负面影响，有利于害虫生物防治和综合治理体系的实施；(3)对由于基因突变产生的抗性问题，很容易通过改变小RNA的序列来解决，以变制变，因此不会产生严重的抗性问题。附图说明图1是实施例1合成的dsRNA的纯度检测结果示意图；其中，M-Marker, 1、2泳道-dsRNA，箭头所指为合成的SLAWD dsRNA。图2是dsRNA注射24h后对6龄斜纹夜蛾发育的影响。图3是注射dsRNA后对6龄斜纹夜蛾蛹发育的影响。图4是注射dsRNA后对6龄斜纹夜蛾翅发育的影响。图5是注射dsRNA后对6龄斜纹夜蛾翅盘异常发育基因转录表达的影响。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1斜纹夜蛾翅盘异常发育基因片段的获得及其dsRNA的合成，包括以下步骤:(1)斜纹夜蛾翅盘异常发育基因片段的获得根据NCBI数据库中登录号为JF690666的斜纹夜蛾翅盘异常发育基因序列，采用primer premier5.0软件设计特异性引物,上游引物序列为SEQ ID NO:2，下游引物序列为SEQ ID NO:3，所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。SEQ ID NO:2:ATGATTGCCACTTTGCTATACCSEQ ID NO:3:TTATTCATAAACCCAGTTTTCGGC斜纹夜蛾总RNA的提取按照OMEGA公司的Trizol kit试剂盒进行。利用反转录TaKaRa 试剂盒 PrimerScript Reverse Transcriptase 反转录成第一条链的 cDNA,以此为模板进行PCR扩增获得斜纹夜蛾翅盘异常发育基因片段(即SEQID NO:1)，并对所获得的翅盘异常发育基因片段进行表达纯化。(2)以步骤(I)所获得的翅盘异常发育基因片段为模板，以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5 为引物(SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:5 是按照 T7RiboMAX Express RNAiSystem试剂盒的说明在SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的5’端多加一个T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGG后得到的)，扩增合成dsRNA。得到的dsRN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种昆虫翅盘异常发育基因片段，其特征在于核苷酸序列是SEQ?ID?NO：1。

【技术特征摘要】
1.一种昆虫翅盘异常发育基因片段，其特征在于核苷酸序列是SEQ ID N0:1。2.一种昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA，其特征在于:是以权利要求1所述的昆虫翅盘异常发育基因片段为模板合成的。...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟翔，任顺祥，金丰良，胡俊杰，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：