一种豆状带绦虫18kDa抗原的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于基因生物学技术领域，提供了一种豆状带绦虫18?kDa抗原的制备方法及其应用，激活豆状带绦虫六钩蚴，并进行总RNA提取；以总RNA为模板，合成cDNA；扩增Tp18编码区，并进行Tp18基因的生物信息学分析；对Tp18进行原核表达，并纯化表达蛋白。该制备方法利用RACE?PCR技术从激活的豆状带绦虫六钩蚴总RNA中扩增Tp18基因，构建了pET32a/Tp18表达载体，并经IPTG诱导获得重组蛋白，所获得的重组蛋白具有较好的免疫原性，可作为豆状带绦虫疫苗候选抗原，具有较强的推广与应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因生物学
，尤其涉及一种豆状带绦虫18 kDa抗原的制备方法及其应用。
技术介绍
豆状带绦虫是犬科动物(终末宿主)和兔形目动物(中间宿主)的常见寄生虫，其中绦期幼虫引起的豆状囊尾蝴病给家兔养殖业带来了巨大的经济损失。豆状带绦虫呈世界性分布，成虫寄生于犬、狐狸等终末宿主的小肠，中绦期幼虫一一豆状囊尾蝴寄生于家兔等兔形目动物的肝脏被膜、胃大网膜和肠系膜等部位，可引起家兔消瘦和抗病力减弱，甚至死亡。中国是世界养兔大国，兔豆状囊尾蝴病在我国广泛流行，给养兔业带来巨大的经济损失。目前兔豆状囊尾蝴病的防治仍以药物为主，化学药物的长期使用容易导致虫株耐药性的产生和兔产品的药物残留，同时也潜在地威胁着人类健康。要阻断绦虫的传播途径并获得长期的防治效果，其中一个重要措施是筛选虫体自身的保护性抗原制备疫苗。疫苗接种是防治寄生虫病最适当的方法，不仅成本低，长期有效，而且对消费者和环境是安全的。天然虫体抗原由于来源受到限制，临床上很难推广使用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种豆状带绦虫18 kDa抗原的制备方法及其应用，旨在解决当筛选虫体自身的保护性抗原制备疫苗来阻断绦虫的传播途径时，天然虫体抗原由于来源受到限制，临床上很难推广使用的问题。本专利技术的目的在于提供一种豆状带绦虫18 kDa抗原的制备方法，该制备方法包括以下步骤:步骤一，激活豆状带绦虫六钩蝴，并进行总RNA提取；步骤二，以总RNA为模板，合成cDNA ；步骤三，扩增TplS编码区，并进行TplS基因的生物信息学分析；步骤四，对TplS进行原核表达，并纯化表达蛋白。进一步，步骤一，激活豆状带绦虫六钩蝴，并进行总RNA提取的实现方法为:从自然感染的家兔体内采集新鲜的豆状囊尾蝴感染犬，五周后收集节片并用PBS缓冲液洗净后保存于4°C的保存液；将收集到的200个节片先用PBS缓冲液冲数次，在1.5 mL的离心管中剪碎，1%的胃蛋白酶液37°C孵育I h，3000 r/min离心5 min收集虫卵，并PBS缓冲液漂洗三次；用1%的次氯酸钠溶液孵化虫卵，在显微镜下观察到卵壳破壳率达90%时，立即加入等量的0.2 Μ/L的硫代硫酸钠终止反应，3000 r/min离心后5min用PBS缓冲液漂洗三次；加入含胰酶和兔 胆汁的孵化激活液于37°C孵育45min，3000 r/min离心5min后弃上清，PBS缓冲液漂洗三次，利用0.4%的台盼蓝检查激活六钩蝴的活力；激活后的六钩蝴活力达70%以上时，使用Trizol试剂进行总RNA的提取。进一步，保存液中包含100 IU/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素及0.25 mg/mL两性霉素B。进一步，步骤二，以总RNA为模板，合成cDNA的实现方法为:根据四川农业大学动物寄生虫学实验室测序完成的豆状带绦虫转录组数据，以总RNA为模板,利用SuperScriptTM II Reverse Transcriptase,结合5’末端通用接头引物smartTM III和3’末端通用接头引物BRL-Al进行逆转录PCR (RT-PCR)以合成cDNA的第一条链；RT-PCR反应体系如下:以 3-5 μ g 总 RNA、1 μ L 10 mM smart IILI μ L 10 mM BRL-A1、适量的 DEPC dH20、Iμ L 20 X RNAsafe在冰上配置反应混合液12 μ L ;70°C反应10 min后放置于冰上；将上一步反应产物润旋混勻后，与4 μ L 5 X first-strand buffer>2 μ L I 0.1MDTT> IuL 10 mM dNTP> IuL SuperScript II Reverse Transcriptase (200 units/ μ L)在冰上配制20 μ L cDNA合成反应液；产物冰上放置I min以终止第一链的合成，cDNA产物_20°C备用。进一步，步骤三，扩增TplS编码区的实现方法为: 第一轮PCR时将cDNA稀释10倍，扩增体系为25 μ L，其中PCR mixture 12.5μ L ；10 pmol/μ L正反向引物各I μ L ;模板cDNA I μ L,加灭菌超纯水至25 μ L ;PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现目的片段，且有清晰可见的条带，第二轮PCR扩增时将此产物稀释100倍后扩增，如果无清晰条带，第二轮时则将第一轮PCR产物稀释10倍后扩增，扩增体系和条件同第一轮；第二轮扩增后将PCR产物1%琼脂糖电泳，切下目的片段胶条，使用柱式DNA胶回收试剂盒进行PCR产物的回收纯化，回收产物测序3次。进一步，第一轮PCR的扩增条件为:94°C预变性5 min ;35个循环，每个循环中94°C变性 50 s，58°C退火 45 s，72°C延伸 50 s ;最后 72°C延伸 10 min。进一步，TplS基因的生物信息学分析的实现方法为:利用Clustal x1.83程序对豆状带绦虫、多头带绦虫(T.multiceps,GeneBank:GI ACS35307)、猪带绦虫(T.solium, GeneBank: GI MD 09326)、牛带绦虫(T.saginata,GeneBank: GI AD086979)、亚洲带绦虫(T.asiatica, GeneBank: GI AD086980)和羊带绦虫(T.0vis, GeneBank: GI AAB49686)的18 kDa抗原氨基酸序列进行多重比对；PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和 PredictProtein (http://www.predictprotein.0rg/)分析蛋白质的二级结构。进一步，其他生物信息学分析涉及到有:(Dcaltor程序分析核酸序列的稀有密石马子(http://people.mb1.ucla.edu/sumchan/caltor.html) ； (2) ProtParam 分析蛋白质氨基酸的组成；(3) ProtScale 程序(http://web.expasy.0rg/protscale/)分析氨基酸序列的亲疏性 / 疏水性；(4) COILS (http://www.ch.embnet.0rg/software/C0ILS_form.html)预测卷曲螺旋(coiled-coil) ； (5) SignalP 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析氨基酸序列中的信号肽位点；(6)TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白的跨膜结构；(7) BepiPred1.0Server (http: //WWW.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)分析存在的抗原表位点。进一步，步骤四，对TplS进行原核表达，并纯化表达蛋白的实现方法为:PCR扩增Tp 18目的片段；构建并鉴定Τρ18基因的T-载体；鉴定重组质粒，并构建原核表达载体；诱导表达重组蛋白，并进行条件优化；制备并纯化重组蛋白。进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种豆状带绦虫18?kDa抗原的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：步骤一，激活豆状带绦虫六钩蚴，并进行总RNA提取；步骤二，以总RNA为模板，合成cDNA；步骤三，扩增Tp18编码区，并进行Tp18基因的生物信息学分析；步骤四，对Tp18进行原核表达，并纯化表达蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种豆状带绦虫18 kDa抗原的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤: 步骤一，激活豆状带绦虫六钩蝴，并进行总RNA提取； 步骤二，以总RNA为模板，合成cDNA ； 步骤三，扩增TplS编码区，并进行TplS基因的生物信息学分析； 步骤四，对TplS进行原核表达，并纯化表达蛋白。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一，激活豆状带绦虫六钩蝴，并进行总RNA提取的实现方法为: 从自然感染的家兔体内采集新鲜的豆状囊尾蝴感染犬，五周后收集节片并用PBS缓冲液洗净后保存于4°C的保存液； 将收集到的200个节片先用PBS缓冲液冲数次，在1.5 mL的离心管中剪碎，1%的胃蛋白酶液37°C孵育I h，3000 r/min离心5 min收集虫卵，并PBS缓冲液漂洗三次； 用1%的次氯酸钠溶液孵化虫卵，在显微镜下观察到卵壳破壳率达90%时，立即加入等量的0.2 M/L的硫代硫酸钠终止反应，3000 r/min离心5min后用PBS缓冲液漂洗三次； 加入含胰酶和兔胆汁的孵化激活液于37°C孵育45min，3000 r/min离心5min后弃上清，PBS缓冲液漂洗三次，利用0.4%的台盼蓝检查激活六钩蝴的活力； 激活后的六钩蝴活力达70%以上时，使用Trizol试剂进行总RNA的提取。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，保存液中包含100IU/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素及0.25 mg/mL两性霉素B。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二，以总RNA为模板，合成cDNA的实现方法为: 根据测序完成的豆状带绦虫转录组数据，以总RNA为模板，利用SuperScriptTM IIReverse Transcriptase,结合5’末端通用接头引物smart TM III和3’末端通用接头引物BRL-Al进行逆转录PCR (RT-PCR)以合成cDNA的第一条链； RT-PCR反应体系如下:以 3-5μ g 总 RNA、1 μ L 10 mM smart II1、I μ L 10 mM BRL-A1、适量的 DEPC dH20、lμ L 20 X RNAsafe在冰上配置反应混合液12 μ L ; 70°C反应10 min后放置于冰上； 将上一步反应产物涡旋混匀后，与4 μ L 5Xfirst-strand buffer,2 μ L 0.1M DTT、I μ L 10 mM dNTP、l μ L SuperScript II Reverse Transcriptase(200 units/μ L)在冰上配制20 μ L cDNA合成反应液； 产物冰上放置I min以终止第一链的合成，cDNA产物_20°C备用。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤三，扩增TplS编码区的实现方法为: 第一轮PCR时将cDNA稀释10倍，扩增体系为25 μ L，其中PCR mixture 12.5μ L ；10pmol/μ L正反向引物各I μ L ;模板cDNA I μ L,加灭菌超纯水至25 μ L ; PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现目的片段，且有清晰可见的条带，第二轮PCR扩增时将此产物稀释100倍后扩增，如果无清晰条带，第二轮时则将第一轮PCR产物稀释10倍后扩增，扩增体系和条件同第一轮； 第二轮扩增后将PCR产物1%琼脂糖电泳，切下目的片段胶条，使用柱式DNA胶回收试剂盒进行PCR产物的回收纯化，回收产物测序3次。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，第一轮PCR的扩增条件为:94°C预变性·5 min ;35个循环，每个循环中94°C变性50 s，58°C退火45 s，72°C延伸50 s ;最后72°C延伸 10 min。7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，TplS基因的生物信息学分析的实现方法为: 利用Clustal X1.83程序对豆状带绦虫、多头带绦虫、猪带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫和羊带绦虫的18 kDa抗原氨基酸序列进行多重比对；利用PSIPRED和PredictProtein分析蛋白质的二级结构。8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其他生物信息学分析涉及到有:(I)caltor程序分析核酸序列的稀有密码子；(2) ProtParam分析蛋白质氨基酸的组成；(3) ProtScale程序分析氨基酸序列的亲疏性/疏水性；(4) COILS 预测卷曲螺旋(coiled-coil) ； (5)SignalP 4.0 Server在线分析氨基酸序列中的信号...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨光友，杨德英，彭雪蓉，古小彬，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
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