一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因及其表达纯化方法和用途技术

本发明专利技术属于DNA重组技术，特别是涉及编码动物蛋白的基因，更为具体的说是涉及一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因、及其表达纯化方法和通途。根据少棘蜈蚣天然毒素序列，设计了适合在大肠肝菌中表达的DNA序列，并在大肠杆菌中重组表达，获得了具有明显抗昆虫活性的少棘蜈蚣抗昆虫毒素。利用本发明专利技术获得的重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a对昆虫具有强烈的神经毒性和致死作用。可用于制备神经生物学研究试剂和生物杀虫剂，也可用于蜈蚣神经毒素空间结构及药理学活性等研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于DNA重组技术，特别是涉及编码动物蛋白的基因，更为具体的说是涉及一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因、及其表达纯化方法和通途。
技术介绍
蜈蚁(centipede)是节肢动物门Arthropoda唇足纲Chilopoda动物的总称，全世界约有 3300 种(Edgecombe, G.D.，Giribet, G.，Ann.Rev.Entomo1.2007.52，151-170.)。蜈蚣科Scolopendridae蜈蚣(以下所称蜈蚣皆为此类)为其中最凶猛的捕食性动物，主要以昆虫和小型无脊椎动物为食；大型蜈蚣也能捕食蟾蜍、蛇、以至蝙蝠和大鼠等脊椎动物。蜈蚣通过向猎物注入毒液，直接杀死或麻痹猎物而捕食之。与蜘蛛、蝎等捕食性节肢动物一祥，在长期的进化过程中，蜈蚣毒液系统发展出了一系列结构独特、性能高效且特异的毒素。然而，与对蜘蛛和蝎各近百种抗昆虫毒素的深入研究相比，人们对蜈蚣抗昆虫毒素的石开究相当薄弱(E.F.Schwartz, C.B.F.Mourao, K.G.Moreira, T.S.Camargos, M.R.Mortari,Pept Sc1.2012.98(4):385-405.)，迄今未见一例蜈蚣抗昆虫毒素基因的重组表达。最新的研究掲示，蜈蚣毒液中不仅含有高丰度的新型高分子量毒液蛋白/酶类，也含有分子骨架显著不同于已知毒素的多肽类毒素(E.A.B.Undheim等，Toxicon57(2011)512-524)，包括多种离子通道毒素(Yang 等，Mol Cell Proteomics.2012 ;11 (9):640-50.)，因而被学界称为“新型生物活性分子的丰富来源”。从蜈蚣毒液中分离获得新的高效、特异的昆虫神经毒素基因及其多肽，进而重组表达或通过转基因技术进入相应的受体，在开发新的神经生物学研究试剂和农业与环境害虫的生物防治中，具有广阔的应用前旦o
技术实现思路
本专利技术根据少棘蜈蚣天然毒素序列，设计了适合在大肠肝菌中表达的DNA序列，并在大肠杆菌中重组表达，获得了具有明显抗昆虫活性的少棘蜈蚣抗昆虫毒素。具体来说，本专利技术提供了一种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm〗.1基因，是序列表中SEQ ID NOl的核苷酸序列，其具体序列为:CAG GTG CTG GTT GAA GAC GAT GTCCCG TTC CCG GAA MG MG TTC GCC GAC CGT GGT GAA TGT ATC CGT GCG TGT GCT GCC AAGTTT ACC GAT GGC GAC CTG AGC AAA ATC AAA GAT GTG CTG CCG CGT TAC TAC AAG TGTGTG TGT TGG TAT TAT CCG ACC TCG TAA。同时,本专利技术还公开了重组蜈蚁抗昆虫毒素Scolotoxin_Ssm2.1基因突变形成至少含有64%的与SEQ ID NOl中的密码子相同的突变体基因。根据本专利技术的专利技术目 的，专利技术人对预测的少棘蜈蚣天然毒素Sc0l0t0Xin-Ssm2a成熟肽的55个氨基酸残基序列按大肠杆菌高表达基因简并密码子的相对使用频率作优化设计，改造了其中36个密码子(占55个密码子的65.5% )的42个位点，使改造后的Scolotoxin-Ssm2.1更适于在大肠杆菌中表达。同时根据重组克隆的需要，在该基因的末端加上限制性内切酶XhoI的识别序列,采用化学合成法合成了全长的Scolotoxin-Ssm2.1成熟肽结构基因，经DNA测序证实合成的基因与设计的完全一致。进ー步地，本专利技术公开了ー种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因的表达纯化方法，包括如下步骤:A，构建含有重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因或含有重组蜈蚣抗昆虫韋素 Scolotoxin_Ssm2.1 突变体基因的重组质粒 pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.1 ；B，将重组质粒pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.1转化至宿主细胞中，得到含有重组质粒的工程菌株；C，上述工程菌株经IPTG诱导，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体；D，将上述菌体清洗、离心、超声破碎，收集上清液；E，将上清液反复通过Ni2+-1DA亲和层析柱纯化，得到融合蛋白；F，上述融合蛋白经过SUMO蛋白酶酶切，得到重组蜈蚣抗昆虫毒素rbcolotoxin-Ssm2a0特别地，本专利技术还公开了上述步骤c的具体步骤为:将重组质粒的工程菌株接种到LB培养基溶液中，当工程菌培养液浓度OD6tltl达到0.6 0.8吋，逐步加入IPTG至终浓度0.5mol/L,于18°C表达6小时,获得含有重组蜈蚁抗昆虫毒素的菌体。进ー步地，本专利技术还公开了所述宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。 利用本专利技术所公开的表达纯化方法，可以获得重组蜈蚣抗昆虫毒素，根据SDS-PAGE和胶图扫描灰度分析，蛋白表达量占菌体总蛋白的24.79%。更进一歩地，本专利技术还公开了由重组蜈蚣抗昆虫毒素基因表达得到的重组蜈蚣抗Si虫讀素 rScolotoxin_Ssm2a0以及上述毒素rScolotoxin-Ssm2a在制备神经毒性类制剂中的应用，特别是在制备杀虫剂中的应用。利用本专利技术获得的重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a对昆虫具有强烈的神经毒性和致死作用。可用于制备神经生物学研究试剂和生物杀虫剂，也可用于蜈蚣神经毒素空间结构及药理学活性等研究。最后，本专利技术还公开了所述重组蜈蚣抗昆虫毒素rSC0l0t0Xin-Ssm2a中含有两对正确连接的共价ニ硫键，这一高活性重组蜈蚣抗昆虫毒素的蛋白结构形式。本专利技术实施中对昆虫神经毒性的活性检测采用昆虫整体活性測定法，对三种不同昆虫作腹腔注射鉴定，结果(见表1、2和图9)表明基因工程产生的重组多肽rScolotoxin-Ssm2a具有明显的昆虫神经毒性和杀虫效果。附图说明图1少棘蜈蚁天然毒素基因Scolotoxin_Ssm2.1的DNA序列测定图谱。图2重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素合成基因Scolotoxin-Ssm2.1与天然Scolotoxin-Ssm2.1基因及其编码的氨基酸序列比对图；其中第一行为少棘蜈蚁天然毒素基因Scolotoxin_Ssm2.1的DNA序列，为了方便标示，仅给出与人工设计序列不同的碱基，其余未标出部分与第二行中的碱基相同；第二行为重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素合成基因Scolotoxin-Ssm2.1的DNA序列；第三行为对应的重组少棘蜈蚁抗昆虫毒素Scolotoxin_Ssm2a的多肽序列。图3重组少棘蜈蚁抗昆虫毒素合成基因Scolotoxin_Ssm2.1的DNA序列测定图レ曰。图4表达载体pSUMO-Mutant的物理图谱和多克隆位点示意。图5重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.1的构建流程图6重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.1的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳中M:分子量标记，1:重组质粒Xhol/Xbal酶切結果，2:空载质粒Xhol/Xbal酶切结果。图7经过IPTG诱导的工程菌表达融合蛋白的SDS-PAGE分析图谱图中M:分子量标记；1:未诱导菌总蛋白；2、3:诱导菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin?Ssm2.1基因，其特征是：SEQ?ID?NO1的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因，其特征是:SEQ ID NOl的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的ー种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm〗.1基因，其特征是:重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因突变形成至少含有64%的与SEQ ID NOl中的密码子相同的突变体基因。3.一种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因的表达纯化方法，其特征是包括如下步骤: A，构建含有重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因或含有重组蜈蚣抗昆虫毒素 Scolotoxin_Ssm2.1 突变体基因的重组质粒 pSUMO-M- Scolotoxin-Ssm2.1; B,将重组质粒pSUMO-M- Scolotoxin-Ssm2.1转化至宿主细胞中，得到含有重组质粒的工程菌株； C，上述工程菌株经IPTG诱导，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体； D，将上述菌体清洗、离心、超声破碎，收集上清液； E，将上清液反复通过Ni2+-1DA亲和层析柱纯化，得到融合蛋白； F，上述融合蛋白经过SUMO蛋白酶酶切，得到重组蜈蚣抗昆虫毒素rbcolotoxin-Ss...

【专利技术属性】
技术研发人员：华卫建，
申请(专利权)人：江苏教育学院，
类型：发明
国别省市：