本发明专利技术涉及一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用。本发明专利技术通过构建cDNA文库，从中国江苏少棘蜈蚣毒腺中克隆得到蜈蚣抗昆虫毒素基因。并通过将密码子优化后全合成的重组蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2与载体pSUMO-Mutant连接得到重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2，将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3)，筛选得到高效表达菌株。表达产物经亲和层析，得到具有生物学活性的多肽——rScolotoxin-Ssm2b。本发明专利技术提供的多肽rScolotoxin-Ssm2b具有昆虫神经毒性和昆虫致死作用，可用于制备神经生物学研究的工具试剂和生物杀虫剂，也可用于蜈蚣神经毒素空间结构及药理学活性等研究。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用。本专利技术通过构建cDNA文库，从中国江苏少棘蜈蚣毒腺中克隆得到蜈蚣抗昆虫毒素基因。并通过将密码子优化后全合成的重组蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2与载体pSUMO-Mutant连接得到重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2，将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3)，筛选得到高效表达菌株。表达产物经亲和层析，得到具有生物学活性的多肽——rScolotoxin-Ssm2b。本专利技术提供的多肽rScolotoxin-Ssm2b具有昆虫神经毒性和昆虫致死作用，可用于制备神经生物学研究的工具试剂和生物杀虫剂，也可用于蜈蚣神经毒素空间结构及药理学活性等研究。【专利说明】—种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用
本专利技术涉及一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用，更为具体的说是涉及一种中国江苏少棘蜈蚣抗昆虫毒素基因SC0l0t0Xin-Ssm2.2及其编码的多肽Scolotoxin-Ssm2b和该多肽的重组制备技术，以及该毒素在神经生物学研究和杀虫药物开发中的应用。
技术介绍
蜈蚁(centipede)是节肢动物门Arthropoda唇足纲Chilopoda动物的总称，全世界约有 3300 种(Edgecombe, G.D., Giribet, G., Ann.Rev.Entomo1.2007.52,151-170.)。蜈蚣科蜈蚣(以下所称蜈蚣皆指此类)为其中最凶猛的捕食者，主要以昆虫和小型无脊椎动物为食，大型蜈蚣也能捕食蟾蜍、蛇、以至蝙蝠和大鼠等脊椎动物。蜈蚣通过向猎物注入毒液，直接杀死或麻痹猎物而捕食之。与蜘蛛、蝎等捕食性节肢动物一样，在长期的进化过程中，蜈蚣毒液系统发展出了一系列结构独特、性能高效且特异的毒素。然而，与对蜘蛛和蝎各近百种抗昆虫毒素的深入研究相比，人们对蜈蚣抗昆虫毒素的研究相当薄弱(E.F.Schwartz等,Pept Sc1.2012.98 (4): 385 - 405.),迄今仅见一例蜈虫公抗昆虫毒素基因的重组表达(中国专利CN 103088030A)。最新的研究揭示，蜈蚣毒液中不仅含有高丰度的新型高分子量毒液蛋白/酶类，也含有分子骨架显著不同于已知毒素的多肽类毒素(E.A.B.Undheim等，Toxicon.57 (2011) 512 - 524),包括多种离子通道毒素(Yang 等，Mol Cell Proteomics.2012; 11 (9):640-50.;Liu 等，J Proteome Res.2012; 11 (12):6197-212.)，因而被学界视作“新型生物活性分子的丰富来源”。从蜈蚣毒腺中分离获得新的高效、特异的昆虫神经毒素基因及其多肽，进而重组表达或通过转基因技术进入相应的受体，在开发新的神经生物学研究试剂和农业与环境害虫的生物防治中，具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种全新的一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用，并进一步得到可以应用于神经毒性类制剂，特别是杀虫剂的多肽产物重组蜈蚣抗昆虫毒素rSC0l0t0Xin-Ssm2b。在这一过程中，我们还同时得到了一种重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2。本专利技术通过构建cDNA文库和测序的方法，从中国江苏少棘蜈蚣毒腺中分离获得了新的蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm〗.2及其编码的抗昆虫毒肽SC0l0t0Xin-Ssm2.2b。通过密码子优化合成了重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2，在大肠杆菌中表达、纯化得到重组蜈蚣抗昆虫毒素rSC0l0t0Xin-Ssm2b。进而检测验证了该重组蜈蚣抗昆虫毒素的昆虫神经毒性及其在制备神经毒性类制剂与杀虫剂中的应用可能，从而达到了本专利技术的专利技术目的。本专利技术所选择的蜈蚁属于少棘蜈蚁(5: subspinipes,采自江苏省南京市。本专利技术包括以下技术方案: 一种蜈蚣抗昆虫毒素多肽，具有SEQ ID NOl的氨基酸序列的多肽、或者其保守性变异多肽、或其活性衍生物。该抗昆虫毒素多肽选自以下组之一: (a)由SEQID NOl所示的氨基酸序列组成的多肽； (b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、添加或修饰而形成的具有相同功能的由(a)衍生的多肽。一种多核苷酸，该多核苷酸包含有选自以下组之一的核苷酸序列: (a)编码2中的多肽的多核苷酸；也就是说编码SEQID NOl中的氨基酸序列的核苷酸序列，以及编码与SEQ ID NOl所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NOl衍生的多肽； (b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。所述多核苷酸具有如SEQ ID N02所示的核苷酸序列。一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2，具有如SEQ ID N03所示的核苷酸序列。一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2的表达纯化方法，包括如下步骤: A，构建含有重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2或含有重组蜈蚣抗昆虫毒素基因 rScolotoxin_Ssm2.2 突变体基因的重组质粒 pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.2; B，将重组质粒pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2转化至宿主细胞中，得到含有重组质粒的工程菌株； C，上述工程菌株经IPTG诱导，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体； D，将上述菌体清洗、离心、超声破碎，收集上清液； D，将上清液反复通过Ni2+-1DA亲和层析柱纯化，得到融合蛋白； E,上述融合蛋白经`过SUMO蛋白酶酶切，得到重组蜈蚣抗昆虫毒素多肽rScolotoxin-Ssm2b。本专利技术还特别公开了重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2的具体合成方法: 首先，按照大肠杆菌的密码子偏好将蜈蚁毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2的cDNA序列优化，在该基因的5’端和3’端分别加入限制性内切酶Stu I和Xho I的酶切位点，采用化学合成法合成了全长的Scolotoxin-Ssm2.2成熟肽结构基因，经DNA测序证实合成的基因与设计的完全一致。其次，通过限制性内切酶Stu I和Xho I双酶切法对载体pSUMO-Mutant进行酶切后得到线性化的载体pSUMO-Mutant。最后，利用DNA连接酶连接上述优化改造过的蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin_Ssm2.2和线性化的载体pSUMO-Mutant,得到重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2。本专利技术同时还公开了上述步骤C的具体步骤为:将含重组质粒的工程菌株接种到LB培养液中，当工程菌培养液浓度OD6tltl达到0.6^1.0时，加入IPTG至终浓度0.5mol/L,于18°C表达6小时，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体。本专利技术进一步公开了步骤B中所述的宿主细胞是大肠杆菌BL21 (DE3)。采用这一宿主细胞后，本专利技术所公开的多肽的表达方法可以描述为:(1)将重组表达质粒pSUM0-M-S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗昆虫毒素多肽，其特征是：具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽、或者其保守性变异多肽、或其活性衍生物。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：华卫建，
申请(专利权)人：江苏教育学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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