电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法及其试剂盒技术

本发明专利技术属于蛋白凝胶电泳分离领域，具体涉及电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法及其试剂盒。该电泳分离方法是基于酸性条件下Cu2+与蛋白质中氨基酸残基的选择性配位作用，使得蛋白质不仅由碱性氨基酸残基的质子化带上正电荷，而且还由金属离子的选择性配位作用使相似氨基酸序列组蛋白异构体带上不同的正电荷，施加直流电后，带不同正电荷的组蛋白异构体具有不同迁移速率，从而得以分离；一维电荷分离后，可进一步进行SDS-PAEG凝胶电泳，利用电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳实现对组蛋白异构体的分离。本发明专利技术电泳分离方法操作过程简单，分辨率高，成本低，克服了现有技术中等电点聚焦电泳容易发生蛋白质沉淀以及对组蛋白异构体分析的局限性。

【技术实现步骤摘要】
电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法及其试剂盒
本专利技术属于蛋白凝胶电泳分离领域，具体涉及电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法及其试剂盒。
技术介绍
组蛋白是真核细胞染色质中的碱性蛋白，也表观遗传的物质基础，大量研究表明组蛋白与许多人类重大疾病的发生发展密切相关，因此组蛋白的分离和鉴定对认识基本生理病理过程具有重要意义。然而，各种组蛋白异构体结构非常相似，而且存在大量翻译后修饰，这使分析技术面临很大挑战。现有的凝胶电泳技术中，一般采用等电点聚焦进行第一维分离，再采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行第二维质量分离。等电点聚焦的缺点主要有两个方面：(1)碱性蛋白的分辨能力差；(2)蛋白质容易沉淀。而且，组蛋白不同异构体的分子量非常相似，这使得第二维的质量分离能力也受到影响。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是针对现有技术的不足，提供电荷-质量聚焦二维凝胶电泳分离方法及其试剂盒。本专利技术所述电泳分离方法可以将组蛋白异构体从蛋白样品中有效的分离出来。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)组蛋白生物样品预处理：配制样品质子化缓冲溶液，将组蛋白生物样品溶解于所述样品质子化缓冲溶液中，得到质子化组蛋白生物样品溶液；再向质子化组蛋白生物样品溶液中加入CuSO4溶液，使Cu2+与组蛋白充分结合，得到组蛋白生物样品上样液；(2)第一维电荷电泳分离：制备吐温-醋酸-尿素浓缩胶和吐温-醋酸-尿素分离胶，采用常规电泳系统进行第一维电荷电泳分离，将步骤(1)得到的组蛋白生物样品上样液加样至上样口，施加电压开始电泳，电泳结束后，得到第一维电荷电泳分离凝胶胶条；(3)将步骤(2)得到的第一维电荷电泳分离凝胶胶条进行脱色和染色后得到第一维电荷电泳分离电泳图；或者将步骤(2)得到的第一维电荷电泳分离凝胶胶条切下后横放于十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺分离胶上，加入指示剂，进行第二维SDS-PAGE质量电泳分离，电泳结束后，得到电荷-质量二维电泳分离凝胶胶条，所述电荷-质量二维电泳分离凝胶胶条经染色和脱色后得到电荷-质量二维电泳分离凝胶电泳图。上述方案中，所述样品质子化缓冲溶液的各组分配比为：尿素0.36g，冰醋酸50μl，0.2wt％派洛宁Y溶液60μl，加水定容至600μl。上述方案中，所述质子化组蛋白生物样品溶液配制过程中每1mg组蛋白生物样品所需要的样品质子化缓冲溶液的体积为200～1000μl。上述方案中，所述CuSO4溶液的浓度为40μg/μl，所述CuSO4溶液与组蛋白质子化生物样品溶液按照质量比为1～5:1的比例混合。上述方案中，步骤(2)所述的第一维电荷电泳分离的电泳条件为：首先采用30伏电压运行1小时，待上样液浓缩成一条直线后，再采用100伏电压运行150分钟。上述方案中，步骤(2)中所述吐温-醋酸-尿素浓缩胶的各组分配比为：含60wt％丙烯酰胺和0.4wt％甲叉双丙烯酰胺的水溶液0.5ml、冰醋酸250μl、蒸馏水2.8ml、四甲基二乙胺30μl和10wt％过硫酸铵140μl；步骤(2)中所述吐温-醋酸-尿素分离胶的各组分配比为：尿素3.6g、含60wt％丙烯酰胺和0.4wt％甲叉双丙烯酰胺的水溶液2.5ml、冰醋酸500μl、蒸馏水3.73ml、10vt％(体积百分比)吐温370μl、四甲基二乙胺60μl和10wt％过硫酸铵280μl。上述方案中，步骤(2)所述第一维电荷电泳分离的电泳液为5vt％醋酸水溶液。上述方案中，将步骤(3)所述第一维电荷电泳分离凝胶胶条进行染色的染色液各组分配比为：将考马斯蓝R250溶解在甲醇和水的混合液中，所述考马斯蓝R250的质量浓度为0.1wt％，所述甲醇和水的体积比为1:1；将步骤(3)所述的第一维电荷电泳分离凝胶胶条进行脱色的脱色液各组分配比为：甲醇50wt％、NH4HCO35wt％和水45wt％。上述方案中，所述第二维SDS-PAGE质量电泳分离的电泳条件为：采用70伏电压运行1小时，然后改变电压至120伏继续电泳，当指示剂跑出电泳槽，停止电泳。上述方案中，步骤(3)所述指示剂的各组分配方为：1.25ml0.5MTris-HCl溶液，2.50ml甘油，2.0ml10wt％十二烷基磺酸钠溶液，0.2ml0.5wt％溴酚蓝溶液，50μl1M二硫苏糖醇溶液，加水定容至1ml。电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳试剂盒，包括如下12种试剂：试剂1为样品质子化缓冲溶液，其各组分配比为：尿素0.36g，冰醋酸50μl，0.2wt％派洛宁Y溶液(PyroninY)60μl，加水定容至600μl；试剂2为CuSO4溶液，所述CuSO4溶液的浓度为40μg/μl；试剂3为吐温-醋酸-尿素浓缩胶，其各组分配比为：含60wt％丙烯酰胺和0.4wt％甲叉双丙烯酰胺的水溶液0.5ml、冰醋酸250μl、蒸馏水2.8ml、四甲基二乙胺30μl和10wt％过硫酸铵140μl；试剂4吐温-醋酸-尿素分离胶，其各组分配比为：尿素3.6g、含60wt％丙烯酰胺和0.4wt％甲叉双丙烯酰胺的水溶液2.5ml、冰醋酸500μl、蒸馏水3.73ml、10vt％吐温370μl、四甲基二乙胺60μl和10wt％过硫酸铵280μl；试剂5为第一维电荷分离电泳的电泳液，其组分为：5vt％醋酸水溶液；试剂6为第二维SDS-PAGE质量分离电泳的电泳液，其各组分配比为：Tris碱30.3g、甘氨酸144g、十二烷基磺酸钠10g，加水定容至1L，充分溶解后再稀释10倍；试剂7为第二维SDS-PAGE质量分离电泳分离胶，其各组分配比为：含30wt％丙烯酰胺和0.8wt％甲叉双丙烯酰胺的水溶液6ml，pH为8.8的Tris-HCl/SDS溶液3.75ml，蒸馏水3.75ml，四甲基二乙胺10μl，10wt％过硫酸铵50μl，所述pH为8.8的Tris-HCl/SDS溶液的配制方法为：将91gTris碱溶解于300ml水中，滴加1M的HCl溶液，调节其pH至8.8，加入2g十二烷基磺酸钠，溶解后加水定容至500ml；试剂8为第一维电荷分离电泳的染色液，其各组分配比为：将考马斯蓝R250溶解在甲醇和水的混合液中，所述考马斯蓝R250的质量浓度为0.1wt％，所述甲醇和水的体积比为1:1；试剂9为第二维SDS-PAGE质量分离电泳的染色液，其各组分配比为：将考马斯蓝R250溶解在甲醇、水和醋酸的混合液中，所述考马斯蓝R250的质量浓度为0.1wt％，所述甲醇：水：醋酸的体积比为：5：4：1；试剂10为第一维电荷分离电泳的脱色液，其各组分配比为：甲醇50wt％、NH4HCO35wt％和水45wt％；试剂11为第二维SDS-PAGE质量分离电泳的脱色液，其各组分配比为：甲醇40vt％、醋酸10vt％和水50vt％；试剂12为第二维SDS-PAGE质量分离电泳指示剂，其各组分配比为：1.25ml0.5MTris-HCl溶液，2.50ml甘油，2.0ml10wt％十二烷基磺酸钠溶液，0.2ml0.5wt％溴酚蓝溶液，50μl1M二硫苏糖醇溶液，加水定容至1ml。本专利技术所述组蛋白异构体的电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法的原理为：利用酸性条件下Cu2+与蛋白质中氨基酸残基的选择性配位本文档来自技高网...

【技术保护点】
电荷‑质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）组蛋白生物样品预处理：配制样品质子化缓冲溶液，将组蛋白生物样品溶解于所述样品质子化缓冲溶液中，得到质子化组蛋白生物样品溶液；再向质子化组蛋白生物样品溶液中加入CuSO4溶液，使Cu2+与组蛋白充分结合，得到组蛋白生物样品上样液；（2）第一维电荷电泳分离：制备吐温‑醋酸‑尿素浓缩胶和吐温‑醋酸‑尿素分离胶，采用常规电泳系统进行第一维电荷电泳分离，将步骤（1）得到的组蛋白生物样品上样液加样至上样口，施加电压开始电泳，电泳结束后，得到第一维电荷电泳分离凝胶胶条；（3）将步骤（2）得到的第一维电荷电泳分离凝胶胶条进行染色和脱色后得到第一维电荷电泳分离电泳图；或者将步骤（2）得到的第一维电荷电泳分离凝胶胶条切下后横放于十二烷基磺酸钠‑聚丙烯酰胺分离胶上，加入指示剂，进行第二维SDS‑PAGE质量电泳分离，电泳结束后，得到电荷‑质量二维电泳分离凝胶胶条，所述电荷‑质量二维电泳分离凝胶胶条经染色和脱色后得到电荷‑质量二维电泳分离凝胶电泳图。

【技术特征摘要】
1.电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)组蛋白生物样品预处理：配制样品质子化缓冲溶液，将组蛋白生物样品溶解于所述样品质子化缓冲溶液中，得到质子化组蛋白生物样品溶液；再向质子化组蛋白生物样品溶液中加入CuSO4溶液，使Cu2+与组蛋白充分结合，得到组蛋白生物样品上样液；所述CuSO4溶液的浓度为40μg/μl，所述CuSO4溶液与质子化组蛋白生物样品溶液按照质量比为1～5：1的比例混合；所述样品质子化缓冲溶液的各组分配比为：尿素0.36g，冰醋酸50μl，0.2wt％派洛宁Y溶液60μl，加水定容至600μl；(2)第一维电荷电泳分离：制备吐温-醋酸-尿素浓缩胶和吐温-醋酸-尿素分离胶，采用常规电泳系统进行第一维电荷电泳分离，将步骤(1)得到的组蛋白生物样品上样液加样至上样口，施加电压开始电泳，电泳结束后，得到第一维电荷电泳分离凝胶胶条；所述吐温-醋酸-尿素浓缩胶的各组分配比为：含60wt％丙烯酰胺和0.4wt％甲叉双丙烯酰胺的水溶液0.5ml、冰醋酸250μl、蒸馏水2.8ml、四甲基二乙胺30μl和10wt％过硫酸铵140μl；所述吐温-醋酸-尿素分离胶的各组分配比为：尿素3.6g、含60wt％丙烯酰胺和0.4wt％甲叉双丙烯酰胺的水溶液2.5ml、冰醋酸500μl、蒸馏水3.73ml、10vt％吐温370μl、四甲基二乙胺60μl和10wt％过硫酸铵280μl；(3)将步骤(2)得到的第一维电荷电泳分离凝胶胶条切下后横放于十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺分离胶上，加入指示剂，进行第二维SDS-PAGE质量电泳分离，电泳结束后，得到电荷-质量二维电泳分离凝胶胶条，所述电荷-质量二维电泳分离凝胶胶条经染色和脱色后得到电荷-质量二维电泳分离凝胶电泳图。2.根据权利要求1所述的电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于：所述质子化组蛋白生物样品溶液配制过程中每1mg组蛋白生物样品所需要的样品质子化缓冲溶液的体积为200μl～1000μl。3.根据权利要求1所述的电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于：步骤(2)所述的第一维电荷电泳分离的电泳条件为：首先采用30伏电压运行1小时，待上样液浓缩成一条直线后，再采用100伏电压运行150分钟。4.根据权利要求1所述的电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于：步骤(2)所述第一维电荷电泳分离的电泳液为5vt％醋酸水溶液。5.根据权利要求1所述的电荷-质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法，其特征在于：所述第二维SDS-PAGE质量电泳分离的电泳条件为：采用70伏电压运行1小时，然后改变电压至120伏继续电泳，当指示剂跑出电泳槽，...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟鸿英，张文洋，唐雪妹，郑石，黄璐璐，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42