本发明专利技术公开一种从虾夷马粪海胆体腔液中提取调理素的方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：首先从虾夷马粪海胆的围口膜处抽取海胆体腔液，并在3500-5000r/min的条件下离心10-15min，制得海胆无细胞体腔液；将海胆无细胞体腔液通过截留分子量为3.5kDa的透析膜进行透析脱盐，并在4-6℃的环境下于透析缓冲液中透析60h，所用的透析缓冲液为0.01mol／L的Tris-HCI和0.005mol／LCaCI2的混合溶液，pH8.0，每15h更换一次透析缓冲液，共更换4次；采用SephadexG-200凝胶过滤层析柱进行洗脱，并收集洗脱后的各组分，层析过程中选用CaCI2-Tris缓冲液洗脱；将洗脱的各组分经紫外分光光度计在280nm下测定其中各组分的吸光值，确定峰值，出现峰值一组或几组即为含有调理素的组分。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种提取调理素的方法，特别是一种。
技术介绍
奸夷马粪海胆{Strongylocentrotus,又称中间球海胆，棘皮动物门，游走亚门，海胆纲。虾夷马粪海胆原产于日本北海道和俄罗斯的远东等地沿海，由于其性腺色泽好，味甜，在国际市场上很受欢迎，是日本的海胆类中经济价值最高的种类之一。该种1989年由大连水产学院从日本引入，其后对其人工育苗及增殖等进行了研究，国内每年的种苗生产量 已达亿枚以上，目前已成为我国主要的养殖种类。其出口价格高于我国的其他固有的经济海胆类，发展前进良好。随着海胆养殖规模的扩大，病害问题也日趋严重，这些疾病大都具有传染性，所以一旦感染就会造成很大的损失。目前关于无脊椎动物体腔液内调理素分子的研究日益增多，通过对调理素分子作用的检测，可以深入探究虾夷马粪海胆的体内免疫机理，丰富无脊椎动物的免疫学理论。棘皮动物与其他无脊椎动物一样具有先天性免疫系统，但未发现脊椎动物所具有的获得性免疫。其免疫应答是由参与免疫反应的效应细胞---体腔细胞和多种体液免疫因子共同介导的，如凝集素，溶血素和调理素等共同并直接作用于入侵病原体。一般情况下，侵入的病源微生物在被吞噬细胞识别之前，先由一些“宿主分子”所包被，这些“宿主分子”是一种血浆蛋白质，促进吞噬作用，被称为调理素，这种包被过程就称为调理作用。简言之，调理素是在吞噬细胞和病源目标间起桥梁作用的物质，有助于吞噬细胞对病原的识别和黏附。无脊椎动物体内的调理素样分子也有相似功能。目前，已在贝类、蚯、海星、星虫动物、海胆海参、昆虫等无脊椎动物中也存在一些体液因子，可以有助于吞噬细胞的识别，其功能与脊椎动物的调理素功能相似。目前为止已在无脊椎动物中分离出多种调理素样分子。河蚬{Corbicula fluminea)和福氏海盘车(Asteria forbesi)中分别存在分子量为40 kDa和29.5 kDa的调理素样分子，玉足海参(/7o7o从aria leucospilota)中存在分子量为20kDa的调理素样分子，仿刺参体腔液中存在一种分子量为18 kDa调理素样分，紫球海胆(5: )体腔液中存在可行使调理素功能的SpC3,分子量为130 kDa。但是现在还没有针对虾夷马粪海胆体内调理素的提取方法出现。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种。本专利技术的技术解决方案是:一种，其特征在于:所述的方法按照以下步骤进行: 首先从虾夷马粪海胆的围口膜处抽取海胆体腔液，并在3500-5000r/min的条件下离心10-15min，制得海胆无细胞体腔液；将海胆无细胞体腔液通过截留分子量为3.5kDa的透析膜进行透析脱盐，并在4-6°C的环境下于透析缓冲液中透析60h，所用的透析缓冲液为0.01mol / L的Tris-HCI和0.005mo I / LCaCI2的混合溶液，pH 8.0，每15h更换一次透析缓冲液，共更换4次；采用Sephadex G-200凝胶过滤层析柱进行洗脱，并收集洗脱后的各组分，层析过程中选用CaCI2-Tris缓冲液洗脱； 将洗脱的各组分经紫外分光光度计在280?下测定其中各组分的吸光值，确定峰值，出现峰值一组或几组即为含有调理素的组分。本专利技术同现有技术相比，具有如下优点: 本专利技术所公开的，首次提出从虾夷马粪海胆的体腔液中进行调理素的提取，并且确定提取出来的调理素样分子为一种新的蛋白质；该研究旨在深入探究虾夷马粪海胆吞噬细胞的免疫机理，丰富无脊椎动物补体家族和免疫学理论，并为研发安全，高效的新型海胆免疫增强剂提供理论依据。【具体实施方式】—种，按照以下步骤进行:首先从虾夷马粪海胆的围口膜处抽取海胆体腔液，并在3500-5000r/min的条件下进行离心，其最佳转速为4000r/min，离心处理时间为10_15min，最佳处理时间为lOmin，制得海胆无细胞体腔液；将上述步骤中获得的海胆无细胞体腔液通过截留分子量为3.5kDa的透析膜进行透析脱盐，并在4-6°C (最佳温度为4°C)的环境下于透析缓冲液中透析60h，所用的透析缓冲液为0.01mol / L的Tris-HCI和0.005 mo I / LCaCI2的混合溶液，缓冲液的酸碱度为PH 8.0，在透析过程中更换4次透析缓冲液，每间隔15h —次；将处理后的海胆体腔液采用Sephadex G-200凝胶过滤层析柱进行过滤层析处理，并用CaCI2-Tris缓冲液洗脱，收集各洗脱组分；将洗脱处理后的各组分用紫外分光光度计在280?下测定吸光值，并确定出现峰值的组分，出现峰值的组分中既含有虾夷马粪海胆体腔液调理素。对出现峰值的洗脱液进行SDS-PAGE分析蛋白标准为低分子量蛋白Marker，分子量范围44.3KDa-220.0 kDa，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为10%，起始电压为60 V，当样品跑至基层胶与分离胶分界处时，将电压调至100 V，当样品跑至距分离胶底部0.5 cm时停止电泳，用时约4-5h。用考马斯亮蓝R-250染色，在200KDa处出现一条蛋白条带，进一步计算得分子量为200.45Kda。即所获得的虾夷马粪海胆体腔液调理素的分子量为200.45Kda。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从虾夷马粪海胆体腔液中提取调理素的方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：首先从虾夷马粪海胆的围口膜处抽取海胆体腔液，并在3500?5000r/min的条件下离心10?15min，制得海胆无细胞体腔液；将海胆无细胞体腔液通过截留分子量为3.5kDa的透析膜进行透析脱盐，并在4?6℃的环境下于透析缓冲液中透析60h，所用的透析缓冲液为0.01mol／L?的Tris?HCI和0.005?mol／LCaCI2的混合溶液，pH?8.0，每15h更换一次透析缓冲液，共更换4次；采用Sephadex?G?200凝胶过滤层析柱进行洗脱，并收集洗脱后的各组分，层析过程中选用CaCI2?Tris缓冲液洗脱；将洗脱的各组分经紫外分光光度计在280nm下测定其中各组分的吸光值，确定峰值，出现峰值一组或几组即为含有调理素的组分。
【技术特征摘要】
1.一种从虾夷马粪海胆体腔液中提取调理素的方法，其特征在于:所述的方法按照以下步骤进行: 首先从虾夷马粪海胆的围口膜处抽取海胆体腔液，并在3500-5000r/min的条件下离心10-15min，制得海胆无细胞体腔液； 将海胆无细胞体腔液通过截留分子量为3.5kDa的透析膜进行透析脱盐，并在4-6°C的环境下于透析缓冲液中透析60h，所用的透析缓冲液为0.01mol /...
【专利技术属性】
技术研发人员：李丹彤，张颖，常亚青，宋坚，
申请(专利权)人：大连海洋大学，李丹彤，
类型：发明
国别省市：
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