一种家蚕触角结合蛋白基因、蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种家蚕触角结合蛋白基因、蛋白及其制备方法。该家蚕触角结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。家蚕触角结合蛋白的制备方法是用本发明专利技术的家蚕触角结合蛋白基因构建重组表达载体后导入宿主菌构建基因工程菌，利用IPTG诱导表达蛋白，再经过纯化得到最终蛋白产物。本发明专利技术的ABP基因片段不含信号肽序列，构建的重组表达载体pET-32a-ABP经诱导表达能获得大量重组目的蛋白，为以后研究其三维结构和生物学功能奠定了极其重要的基础，该方法还解决了天然膜蛋白表达量低、难纯化的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
家蚕为鳞翅目昆虫中少数的益虫，家蚕触角结合蛋白(Antennal bindingprotein, ABP)是气味结合蛋白(Odorant binding proteins, OBPsMtJ—个亚类，在昆虫和外界环境进行化学信息交流过程中起着重要作用，对昆虫的觅食、求偶、繁殖都具有重要意义。灵敏的嗅觉对于昆虫的正常生存和适应环境不可或缺，昆虫嗅觉系统是一个高度专一、极其灵敏的化学监测器，能从成千上万种不同气味中识别出低达几百万分之一的某些特异性气味物质。昆虫感受到的气味物质多为脂溶性的小分子化合物，这些小分子物质通过触角上皮细胞间的孔道扩散到达触角感器淋巴液，而触角感器是亲水性的液体，外界亲脂性分子不能直接穿过这些亲水性的液体到达嗅觉神经树突末梢，家蚕触角结合蛋白(ABP)可能在嗅觉神经树突周围液体中溶解并运输脂溶性气味化合物穿过亲水性液体。鳞翅目昆虫中包括了大量农业和林业上的重要害虫，如何有效防治害虫但不污染环境是当前生产中的关键问题，开展家蚕触角结合蛋白的研究不仅有利于指导蚕桑业的生产实践，也可以利用家蚕作为模式生物进行相关研究，将其成果积极应用于鳞翅目害虫的防治。现有技术对于触角结合蛋白的研究较少，张瑶等在“家蚕ABP与ABPX基因定位于表达分析”(昆虫学报，2012) —文中利用`家蚕ABP基因(GenBank登录号:DQ311409)序列，通过RT-PCR方法获取了 ABP基因序列，其位于第5染色体上，由3个外显子和I个内含子组成，外显子序列长度在47 450bp之间，内含子长度3482bp。但是对于家蚕触角结合蛋白的表达和纯化还未见报道，因为该蛋白的表达量非常低、且难于纯化。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术通过构建重组表达载体pET-32a_ABP，摸索诱导表达条件并成功得到大量重组目的蛋白，重组蛋白经镍离子亲和层析柱纯化及凝胶过滤层析等技术可以得到纯度较高的重组蛋白，为以后研究其三维结构和其在信号通路中的功能奠定了极其重要的基础。本专利技术具体技术方案如下:一种家蚕触角结合蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2所示。上述家蚕触角结合蛋白基因的扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3 4所示。一种家蚕触角结合蛋白的重组表达载体，是由上述家蚕触角结合蛋白基因插入到原核表达载体pET-32a的多克隆位点构建而成。一种基因工程菌，其含有上述家蚕触角结合蛋白的重组表达载体。优选地，所述基因工程菌为E.coli BL21。一种家蚕触角结合蛋白的制备方法，包括如下步骤:(1)将权利要求1所述的家蚕触角结合蛋白基因插入到原核表达载体的多克隆位点，构建成重组表达载体，重组表达载体导入宿主菌，构建成基因工程菌，培养基因工程菌，并用IPTG诱导表达蛋白，离心收集菌体，经细胞破碎、离心后收集上清； (2)收集的上清经纤维素膜过滤除去杂质后，过镍离子亲和层析柱，用梯度浓度的咪唑水溶液洗脱，收集咪唑浓度为80 mM时的洗脱液，即得到家蚕触角结合蛋白。优选地，所述培养基因工程菌的培养基为含有Amp抗生素的LB培养基,培养条件是220rpm摇床37°C培养。优选地，所述IPTG的浓度为0.5mM,收集菌体前的离心速率为lOOOrmp。优选地，所述细胞破碎具体步骤为:收集的菌体用pH 7.4的PBS洗涤三次，冰浴条件下以200W的功率超声破碎两次，每次以超声Is停2s的方式循环共30min ;收集上清前的离心条件为12000rmp离心lOmin。优选地，所述纤维素膜的孔径为0.45 U m0本专利技术具有以下有益效果: ABP含有21个氨基酸的信号肽，通过分析发现，正是由于携带信号肽序列，导致蛋白不易结晶，根据这一发现，本专利技术通过设计引物，从第22个氨基酸开始克隆，得到的不含信号肽的基因，并构建了不含有信号肽的重组表达载体pET-32a-ABP，诱导表达得到大量重组目的蛋白，然后经20m~50mM浓度的咪唑水溶液洗掉未结合的蛋白，80mM浓度的咪唑水溶液洗脱目的蛋白，获得了纯度较高的目的蛋白，操作简易，为以后研究其三维结构和生物学功能奠定了极其重要的基础；由于膜蛋白的表达和纯化是一个世界性的难题，因此本专利技术用基因工程的手段成功表达膜蛋白且其以可溶性的形式存在，为目前研究膜蛋白提供了另一种途径；此外，该方法还解决了天然膜蛋白表达量低、难纯化的问题。附图说明图1是本专利技术J汉0基因片段的PCR扩增产物电泳图，M:DNA Ladder Mix ；1:二次PCR扩增条带。图2是本专利技术基因片段与pET_32a质粒的双酶切产物电泳图，M:DNA LadderMix ；1 基因片段双酶切产物；2:pET-32a质粒双酶切产物。图3是本专利技术重组质粒pET-32a-ABP的PCR产物和双酶切产物电泳鉴定图，M =DNALadder Mix ；1:重组质粒双酶切的产物；2: PCR产物。图4是本专利技术的重组蛋白表达产物电泳图，M:蛋白分子量标准；1:pET-32a(-)空载体诱导对照；2:pET-32a-ABP未诱导对照；3:pET-32a_ABP诱导表达产物。图5是本专利技术的重组蛋白表达产物Western blot图，M:蛋白分子量标准；1:pET-32a(-)空载体诱导对照；2:pET-32a-ABP未诱导对照；3:pET-32a-ABP诱导表达； 图6是本专利技术的重组蛋白破碎后上清在不同浓度下咪唑水溶液的洗涤产物电泳图，M:蛋白分子量标准；I:20mM ；2:40mM ；3:60mM ；4:80mM ；5:100mM ；6:150mM ；7:200mM ；8:500mMo图7是重组蛋白的质谱鉴定图一级质谱。图8是重组蛋白的质谱鉴定图二级质谱。图9是重组表达载体pET-28a_ABP表达产物电泳图，M:蛋白分子量标准，1:空载体诱导，2:重组载体未诱导，3:重组载体诱导。图10是重组表达载体pEGX-4T-l-ABP表达产物电泳图，M:蛋白分子量标准，1:空载体诱导，2:重组载体未诱导，3:重组载体诱导。图11是重组表达载体pEGX-6P-l-ABP表达产物电泳图，M:蛋白分子量标准，1:空载体诱导，2:重组载体未诱导，3:重组载体诱导。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。实施例1扩增基因片段 根据GenBank登录号:DQ311409公开的基因mRNA序列，结合其他同源蛋白的特点，预测其前63bp为编码信号肽的序列，除去不要，直接从第64位开始扩增，引物设计如下:上游引物 Fl: 5’ -CGGAATTCGATAACGTCCACCTTAC-3’ (SEQ ID NO: 3，下划线为 ^boR I酶切位点)；下游引物 Rl: 5，-GCCCTCGAGCAGTGTGTAGTAATTT -3’ ( SEQ ID NO: 4，下划线为 ZAo I酶切位点)。其中下游引物是在终止密码子后的51位加的，由于下游终止密码子的位置下游引物结合不牢固，所以往后找到了一处GC含量高的，可以结合的位置设计了下游引物。 以家蚕蚕蛹总mRNA为模板,用反转录试剂盒(Fer本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种家蚕触角结合蛋白基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种家蚕触角结合蛋白基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示。2.权利要求1所述家蚕触角结合蛋白基因的扩增引物，其特征在于，核苷酸序列如SEQID NO:3^4 所示。3.一种家蚕触角结合蛋白的重组表达载体，其特征在于，由权利要求1所述家蚕触角结合蛋白基因插入到原核表达载体pET-32a的多克隆位点构建而成。4.一种基因工程菌，其特征在于，含有权利要求3所述的家蚕触角结合蛋白的重组表达载体。5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为E.coli BL21。6.一种家蚕触角结合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将权利要求1所述的家蚕触角结合蛋白基因插入到原核表达载体的多克隆位点，构建成重组表达载体，重组表达载体导入宿主菌，构建成基因工程菌，培养基因工程菌，并用IPTG诱导表达蛋白，离心收集菌体，经细胞破碎、离心后收集上清； (...

【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，李晓瑞，李霞，陈剑清，舒特俊，
申请(专利权)人：天津耀宇生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：