家蚕BmSpry基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物基因领域，特别是涉自于家蚕的控制家蚕对核型多角体病毒（BmNPV）抗性的关键基因，所述家蚕BmSpry基因含有如SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；其以家蚕cDNA为模板进行PCR扩增而得，其在调节家蚕型多角体病毒抗性中的应用；BmSpry基因表达量降低一半导致家蚕对BmNPV的抵抗性降低了100倍，本发明专利技术克隆和鉴定一个影响家蚕对BmNPV抗性的关键基因；BmSpry基因在培育家蚕抗BmNPV品种的理论研究和生产应用中都具有重要的价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物基因领域，特别是涉及家蚕的控制家蚕对核型多角体病毒 (BmNPV)抗性的关键基因。
技术介绍
蚕桑生产是丝绸工业的基础，在我国很多农村地区，养蚕业是当地经济的支柱性产业和农民的主要经济收入来源，蚕丝业每年为蚕农创收上百亿元。核型多角体病毒病是蚕业生产上最常见而且危害最严重的一类蚕病，引起该病的病原为核型多角体病毒 (BmNPV)，该病的传染力极强并且难以控制，全国各蚕业主产区经常因为该病的爆发而造成严重的经济损失。由于BmNPV在蚕业生产上危害严重，科研工作者对它的病原特性、感染性和抵抗性作了持续深入的研究。目前的研究结果显示不同的家蚕品种对BmNPV的抵抗性不一样， 家蚕对BmNPV的抵抗性是由多基因控制的，其中至少有一个是主效基因。对家蚕抗性关键基因及其调控序列进行克隆和鉴定，为阐明家蚕抵抗BmNPV的机制，以及培育抗性品种应用于蚕业生产有着重要的理论价值和实践意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一段核苷酸序列及其制备方法，该序列为家蚕调控核型多角体病毒抗性的关键基因。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为家蚕BmSpry基因，所述家蚕BmSpry基因的核苷酸序列含有如SEQ ID NO 1所示。进一步，所述家蚕汝基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。所述的家蚕汝基因的制备方法，以家蚕大造品种全蚕或者组织cDNA为模板进行PCR扩增，设计的上游引物为F 5' - cggtcgtttcgttggagc-3’，设计的下游引物为R 5，- atttgcgtagaatccaaaatactaac-3，，PCR 反应条件为94°C预变性 4 分钟，然后 94°C变性 40秒、58 °C退火40秒、72 °C延伸1分钟，共30个循环，最后72°C延伸10分钟，得如SEQ ID NO 2所示的家蚕BmSpry基因。本专利技术的目的之二在于提供家蚕基因的应用，该应用为调控家蚕核型多角体病毒抗性提供了新方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为所述的家蚕基因在调节家蚕型多角体病毒抗性中的应用。本专利技术的有益效果在于通过对转基因家蚕敏感系统LI-S进行检测，克隆得到了一个家蚕抗性关键基因彻分iT全长序列，包括213bp的5’非翻译区序列(5’Untranslated region，5，UTR)、642bp 编码区序列(Coding sequence，CDS)和 332 bp 的 3，非翻译区序列 (3’UTR)。彻分^基因表达量降低一半导致家蚕对BmNPV的抵抗性降低了 100倍，本专利技术克隆和鉴定了一个影响家蚕对BmNPV抗性的关键基因。汝基因在培育家蚕抗BmNPV品种的理论研究和生产应用中都具有重要的价值。 附图说明图1为LI-S和正常大造添食不同浓度BmNPV以后的死亡率统计结果。图2为LI-S外源片段在家蚕基因组和染色体上的插入位点分析。图3为RT-PCR检测正常大造和LI-A以及LI-S中BmSpry的表达量。图4为定量PCR检测正常大造和LI-A以及LI-S中BmSpry的表达量。图5为插入位点附近其他基因RT-PCR检测结果。图6为BmSpry基因的结构示意图(上)和全长序列及对应的氨基酸序列(下)。具体实施例方式实施例1转基因家蚕LI-S和LI-A的构建一构建转基因增量表达载体pBac 1用幻招/和/双酶切载体pBSII-IEl-orf，回收获得IEl启动子片段，并把其连入 L4440 载体，用 SV40 引物(SV40 F: 5 ‘-tgctctagaagatcataatcagccata-3，，SV40 R: 5 '-ggaagatctgcagtgaaaaaaatgctt-S' )hk piggyBac 中扩增出 SV40 终止信号，由于引物两端分别加有损a /和勒#酶切位点，以此两个酶双酶切把SV40加入已经带有IEl启动子的L4440载体，这样重组载体L4440-IE1P-SV40中既包含IEl启动子序列，又含有SV40终止信号。2 用 Bmlipase-1 弓丨物(Lipase-1 F: 5 '-ccggaattcatgcctgatggcgagggtgt- 3，， Lipase-I R: 5 '-ctagtctagattagaaaggccaactgctgcc-S') ^C H Φ J cDNA Φ Γ ±1 Bmlipase-I的CDS序列(如SEQ ID NO:3所示)，TA克隆连入pMD19_T simple载体，进行 PCR和酶切检测确定无误，并送由上海生物工程有限公司测序做进一步验证。3用损a /和分别双酶切L4440-IE1P-SV40和Bmlipase-1 T克隆质粒，连接重组后，得到含有增量表达骨架结构(包含启动子、表达基因序列和终止信号)的L4440-IElP- Bmlipase-l-SV40 重组载体。4 用 ^7/7 / 和 II 分别酶切 pSLfall80fa 载体禾Π L4440- IElP-Bmlipase-l-SV40 重组载体，连接重组后，得 1180- IElP- Bmlipase-l_SV40 重组载体。5用限制性内切酶Asc I分别酶切1180- IElP- Bmlipase-l_SV40及 piggyBac质粒。由于pSLfall80fa载体骨架在多克隆位点两端都含有一个Asc /位点，切下的增量表达骨架结构便可与经Asc /酶切后5’端去磷酸化的piggyBac 3Xp3 EGFP afm线性片段连接，形成最终的转基因增量表达载体pBac。上述实验的完成参见了西南大学陈杰的《增量表达抗病毒蛋白Bmlipase-1的家蚕转基因系统的建立》一文。二转基因显微注射和阳性个体的筛选1将家蚕大造品种蚕卵浸酸解除滞育以后，放于15°C和80%湿度的黑暗环境中催青直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养，化蛾以后将雌雄蚕蛾交配4h，拆对后产下的蚕卵为非滞育蚕卵，用于下一步的显微注射；2将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐，在蚕卵产后2h用Eppendorf显微注射仪将实施例1所得的转基因增量表达载体pBac 和辅助质粒A3H，一起注射进932粒大造蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25°C、相对湿度 80%的环境中催青孵化，将孵化的510头GO代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾；3 GO代蚕蛾通过自交或回交共获得32蛾圈Gl代蚕卵，用Olympus 电动宏观荧光显微镜观察筛选并获得7个阳性蛾圈，转化效率为21. 88%。三转基因系统的抗性检测1将实施例2所得的7个阳性蛾圈各自单蛾圈饲养，继代扩大得到7个转基因系统Li， 随机选择3个转基因系统进行后续的抗性检测。2取3个转基因系统和正常大造品种，在4龄起蚕时期以半致死剂量单头经口添食BmNPV病毒，4个系统各设置3个重复区，每个重复区100头蚕，同时每个系统设置3个不攻毒对照区，死亡率统计到化蛾时期；3攻毒结果显示3个转基因系统中有两个系统(分别命名为LI-A和LI-B)提高了家蚕对BmNPV的抗性(符合我们的预期结果)，但其中一个系统(命名为LI-SWfBmNPV的抗性明显降低。抗性检测结果显示和正常大造系统相比较，转基因系统LIA—直具有明显的抗性效果，能降低35%左右的死亡率。LI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：夏庆友，蒋亮，金盛凯，程廷才，陆改，徐汉福，王根洪，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：