【技术实现步骤摘要】
改良的凝血因子调节物本申请是申请号为200580019913. 7 (国际申请号为PCT/US2005/013926)、申请日为2005年4月22日、专利技术名称为“改良的凝血因子调节物”的中国专利申请的分案申请。专利
本申请要求2004年4月22日提交的美国临时申请第60/564，873号的优先权。本专利技术是改良药物、组合物以及用核酸配体(例如适体)调节凝血因子药理学活性的方法。
技术介绍
尽管治疗和预防血栓形成事件相当努力，但动脉血栓形成仍旧是发达国家成年人群的主要死因。虽然存在众多治疗血栓形成的医疗策略，但没有药物能满足生物利用度和效力二者的治疗终点，同时又具有合理的安全特性(参见Feuerstein等(1999)Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 19:2554-2562)。在正常环境下，对铺衬血管的血管内皮细胞的伤害通过一系列通常称为凝血“级联”的事件触发止血反应。级联最终将可溶性纤维蛋白原转变成不溶性纤维蛋白，其与血小板一起形成局部凝块或血栓，阻止血管外释放血液组分。然后，可发生伤口愈合，接着凝块溶解，并恢复血管完整性 和流量。凝血的发生起因于两个不同的途径内在途径和外在途径。可通过使血液携带的因子接触人造负电荷表面(如玻璃)体外触发内在途径。相反，当受伤后一般与循环系统隔绝的组织因子(TF)开始接触血液时，可体内或体外启动外在途径。接触血液的TF作为VIIa因子(“FVIIa”)的辅因子，催化IX因子(“FIX”)和X因子(“FX”)活化。这导致快速形成FXa和凝血酶，其随后聚合，形成纤维蛋白凝块。内在途径和...
【技术保护点】
一种分离的核酸配体，其核酸序列如SEQ?ID?NO:17所示。
【技术特征摘要】
2004.04.22 US 60/564873。例如，美国专利第5，670，637号包含覆盖结合蛋白的适体的权利要求。美国专利第5，696，249号要求保护通过SELEX法生产的适体。授予O’Toole的美国专利第5，756，291和5，582，981号公开并要求保护一种使用含限定6核苷酸序列的标记适体检测凝血酶的方法。美国专利第5，476，766和6，177，557号公开了使用SELEX鉴别凝血酶的核酸配体溶液的化合物和方法。Sullenger, Rusconi, Kontos 和 White 在 WO 02/26932 中描述了与在止血和其它生物事件的调节中有用的凝血因子、E2F家族转录因子、AngU Ang2及其片段或肽、转录因子、自身免疫抗体和细胞表面受体结合的RNA适体。另参见Rusconi等，Thrombosis andHaemostasis 83:841-848 (2000)，White 等，J. Clin Invest 106:929-34 (2000)，Ishizaki等，Nat Med 2:1386-1389(1996)和 Lee 等，Nat. Biotechnol. 15:41-45 (1997))。适体的调节授予Duke University的PCT公开号WO 02/096926描述了通过给予调节剂调节核酸配体生物活性的物质和方法。说明书描述了由可为核酸的调节物控制的适体。据描述，可调节适体可用于治疗其中抑制凝血、延伸因子2活性或血管生成很重要的疾病。控制凝血的可调节适体包括凝血因子VII或VIIa、VIII或VIIIa、IX或IXa、V或Va、X或Xa、与这些因子形成的复合物以及血小板受体的适体。调节物可改变核酸配体对其靶的结合，降解或以其它方式切割、代谢或分解核酸配体，同时配体发挥其作用。调节物可基于各种因素按照需要实时给予，这些因素包括患者的病情发展以及医师对如何实现最佳治疗的判断。最大化适体的应用为了使适体成为有用的治疗剂，其应当紧密结合蛋白、抑制该蛋白的特定功能(如果需要拮抗剂的话)以及没有有害的副作用。未修饰的RNA实际上不能用作治疗剂，因为血液富含核糖核酸酶。对单链RNA和DNA的某些修饰可产生在血液中稳定的分子，某些已知适体在各个嘧啶核苷酸中具有2’ F或2’ NH2基团。但是，没有手段来预测具体的修饰如何改变适体。具体地说，当需要额外限制时(可调节适体的情况就是这样)，没有技术来预测一种或多种修饰如何可影响适体调节其配体的能力，同时继续受解毒剂结合的调节。适体成功用作治疗剂不仅取决于其效力和特异性，而且取决于经济性。由目前可用适体的最成功的动物实验外推，l-2mg/kg体重的适体剂量通常是有效剂量(源自对抑制VEGF, PDGF, L-选择蛋白和P-选择蛋白的适体进行的实验)。对于70kg的成年人，这意味着每次注射剂量应为70-140mg。对于急性适应症，例如器官移植、心肌梗死、中毒性或脓毒性休克、血管成形术或肺栓塞，15天中每3天治疗一次会涉及$700-$1400的药物成本。显然，对于慢性适应症，药物成本是个问题。因此，有需要降低适体的生产成本。已开发了几种方法来改良基础SELEX方法，以获得修饰的适体。例如，专利公开了在SELEX法中使用修饰的核苷酸，以获得表现出改良特性的适体。美国专利第5，660，985号提供了宣称表现出增强的体内稳定性的2,-修饰核苷酸。美国专利第6，083，696号公开了“混合的” SELEX法，其中筛选共价连接至非核酸功能单位的寡核苷酸结合靶分子的能力。其它专利描述了对适体的SELEX后修饰，以降低其大小、增加其稳定性或增加靶结合亲和性(参见例如美国专利第5，817，785和5，648，214号)。在美国专利第5，245，022号中，Weis等公开了约12_25个碱基的寡核苷酸，其末端被聚亚烷基二醇取代。这些修饰的寡核苷酸据报道对外切核酸酶活性有抗性。授予Cook等的美国专利第5，670，633和6，005，087号描述了热稳定的2'-氟代寡核苷酸，其与RNA或DNA碱基序列互补。授予Cook等的美国专利第6，222，025和5，760，202号描述了含修饰嘧啶的2' _0取代嘧啶和寡聚物。EP 0593901B1公开了具有末端3'，3'-和5'，5'-核苷键的 寡核苷酸和核酶类似物。授予Gold等的美国专利第6，011，020号公开并要求保护由聚乙二醇修饰的适体。目前，对于需要抗凝血治疗的患者，仍强烈需要提供治疗方法和组合物，具体地说是在手术或其它医学干预过程中。因此，本发明的一个目标是为有抗凝血治疗需要的患者提供治疗方法和组合物，具体地说是在手术或其它医学干预过程中。本发明的另一个目标是提供对抗凝疗法的治疗作用、药动学和活性时程的更多控制。发明内容本发明公开了用于抗凝治疗的改良核酸配体以及与解毒剂组合的改良核酸配体，其中解毒剂改变核酸配体与其靶的结合，或者降解或以其它方式切割、代谢或分解核酸配体，同时配体仍发挥其作用。这些改良适体提供对体内应用更有利的抗凝特性，包括在人或畜手术过程中。当外科医生或其它医疗专家需要时，给予其解毒剂可便利地中和改良适体的抗凝功能。在本发明的一个方面，提供凝血级联中因子的改良核酸配体或适体。在某些实施方案中，所述因子包括IX因子(Fix)或切割产物IXa因子(FIXa)。在某些实施方案中，所述适体是由FIXa和VIIIa因子(FVIIIa)形成的复合物(也称为“内在Tenase复合物”)的配体。在某些实施方案中，适体是抑制FIXa和FVIIIa之间形成复合物的配体。在一个子实施方案中，本发明的适体结合FIX和FVIIIa的复合物，并抑制X因子(FX)活化。在有或没有另外的钙存在时，适体可与FIX、FIXa或FIXa与FVIIIa形成的复合物相互作用。适体还可与细胞膜处的复合物的因子相互作用。在一个实施方案中，适体结合在膜表面的内在Tenase复合物。·[0031]在本发明的另一方面，申请人已发现凝血因子IX(FIX)基因产物及其切割产物IXa因子(FIXa)的改良适体。在一个实施方案中，核酸配体包含至少一个通过Watson-Crick碱基配对结合分子中的另一个区的区(莖),和至少一个在生理条件下不结合分子中的任何其它区的区(环)。在另一个实施方案中，核酸配体包含两个茎(茎I和茎2)和两个环(环I和环2)。通常，茎I为1-15或1-20个核苷酸对长。茎I还可为10、9、8、7、6、5、4、3或2个核苷酸长。一般来说，茎2为1_10个核苷酸长。茎2还可为9、8、7、6、5、4、3或2个核苷酸长。环I和环2的长度也是可变的。环2可为10个核苷酸长，但也可为8个或8个以下核苷酸长，包括7、6、5、4、3或2个核苷酸长。环I的长度也是可变的，在一个实施方案中其在5' -3'方向包含10或9个核苷酸，3' -5'方向包含I个核苷酸。本发明IX因子基因产物的适体可包含核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其组合。一般来说，改良适体为至少25个核苷酸长,通常不长于35-40个核苷酸。在一个实施方案中，适体至少为25、30、35或40个核苷酸长。在具体的实施方案中，茎I的序列在5' -3'方向含5个核苷酸。在一个子实施方案中，茎I在5' -3'方向含3个鸟嘌呤(G)残基。改良适体可包括“自杀位置”。在一个实施方案中，当解毒剂与改良适体结合时，该位置变成...
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