本发明专利技术属于生物技术领域，涉及特异性识别副溶血性弧菌的寡核苷酸适配子的筛选和应用。通过SELEX技术获得了能够特异性识别副溶血性弧菌的寡核苷酸适配子，接着利用流式细胞仪对适配子的亲和力和特异性做了分析，得出亲和力最强，特异性最好的识别副溶血性弧菌的寡核苷酸适配子。该适配子在准确、快速、灵敏检测食品中副溶血性弧菌方面具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)筛选获得一种与副溶血性弧菌高亲和力、高特异性识别的寡核苷酸适配子，以及该寡核苷酸适配子在鉴别副溶血性弧菌中的应用，属生物
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus),系弧菌科弧菌属,革兰染色阴性,兼性厌氧菌，为多形态杆菌或稍弯曲弧菌。副溶血性弧菌是ー种在河、海、港口等环境中自然生长的革兰氏阴性嗜盐菌，它广泛分布于海水及多种水产品中，可引起急性胃肠炎，少数情况还能引发败血病，危及生命。副溶血性弧菌引起的食物中毒，在日本、东南亚、美国等国家及中国台北地区较为多见，在世界范围内被公认是ー种重要的食源性病原菌。在我国，副溶血性弧菌所致食物中毒，在细菌性食物中毒占有重要地位。许多资料表明，副溶血性弧菌已经成为我国一个严重的食源性公共卫生问题之一。因此建立准确、灵敏、快速的副溶血性弧菌检测技术对于食品安全具有重要意义。·传统的微生物检验，往往既耗时又不灵敏；新发展起来的PCR技木，虽然能缩短检验时间，但灵敏度仍然不高；免疫学方法具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点，但制备抗体的时间比较长，成本高·，且不稳定。近些年来，由于寡核苷酸适配子(aptamer)较之抗体有诸多优点成本低，稳定性好，易于修饰等等，因此被作为抗体分子的前景性替代分子，受到很多领域的关注。SELEX是ー种随机生物文库技术，它利用大容量的随机寡核苷酸库(由两端的固定序列和中间20 40个碱基的随机序列组成)与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技木，使其得到指数级富集，如此循环数轮，最終进化成为高亲和力、高特异性的寡核苷酸配体。适配子与靶物质结合的特异性和亲和カ可与抗体媲美，甚至优于抗体，加上其技术上和稳定性方面的优势，近10多年来，采用SELEX技术筛选核酸适配子不断被应用于生命科学各个领域的研究工作中，包括对疾病的诊断与治疗。本专利技术以常见的副溶血性弧菌为目的靶细菌，利用SELEX技术获得了一条能与副溶血性弧菌高亲和力，高特异性结合的寡核苷酸适配子，能够快速、灵敏、特异的检测到副溶血性弧菌。
技术实现思路
本专利技术目的在于提出特异识别副溶血性弧菌的一条寡核苷酸适配子的序列以及应用。本专利技术优点I)与蛋白类抗体相比，aptamer合成周期短,成本低；aptamer更稳定；aptamer可直接体外合成、易于标记，使得操作更为简单迅速。2)该序列是从6条均能识别副溶血性弧菌的aptamers中，选出的亲和カ最强,特异性最好的一条aptamer,能高亲和カ高特异性识别副溶血性弧菌。附图说明图1VP1-VP6的ニ级结构图2VP1-VP6解离常数图3VP1特异性分析图具体实施例方式下面是通过SELEX技术筛选特异性结合副溶血性弧菌的寡核苷酸适配子的方法以及快速检出副溶血性弧菌的应用。1、合成随机单链DNA文库和引物(IDT公司合成)随机ssDNA文库5，-ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-N40-TATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3， 构建了长度为87nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40个碱基的随机序列，库容量在IO14以上；引物1:5’ -ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-3’ ；引物I1:5’ -ATTAGTCAAGAGGTAGACGCACATA-3’，将随机ssDNA文库和引物用TE缓冲液配制成100 u mo I/L贮存液_20°C保存备用。2、BHL液体培养基培养副溶血性弧菌，37 °C摇床培养至对数生长期(0D_ = 0. 3)，收集菌液1800g 4°C离心5min，弃上清，用IX结合缓冲液(IXBB) (50mM Tris-HCl (pH7. 4),5mMKCl,100mM NaCl,lmM MgCl2)清洗，去除多余的培养基成分。3、SELEX筛选获得副溶血性弧菌特异的寡核苷酸适配子I)将ssDNA文库进行PCR扩增，扩增体系为st印1:ssDNA5 ii L，引物1、II各 5 ii L，含 Mg2+的 dNTP 5 y L，Taq 酶 0. 5 y L，10XPCR buffer 5yL，用无菌超纯水补足 50 ii し① 94 0C 5min,② 94 °C 45s,③ 50 °C 45s,④ 72 °C lmin,⑤ go to ②，2times,⑥72°C 5min⑦end。所得PCR产物作为step 2模板，Round 2 :模板I y L，引物1、II各 I U L，含 Mg2+的 dNTP liiL，Taq 酶 0.5 iiL，10XPCR buffer 5yL，用无菌超纯水补足 50 ii し① 94 0C 5min,② 94 °C 45s,③ 50 °C 45s,④ 72 °C lmin,⑤ go to ②，30times,⑥72°C 5min⑦end。所得产物即作为第一轮筛选的文库。在与菌种孵育之前，需将文库于94°C热变性8min，立即冰浴lOmin。第一轮筛选的投入量为2nM，第二轮至最后为lOOpmol。2)将 ssDNA 文库，I X IO8 细菌，tRNA 和 BSA，共 600 y L 室温孵育 45min，使 ssDNA文库与细菌充分結合。3)5000g 4°C离心5min弃上清，用IXBB清洗3次，分离并去除未与细菌结合的ssDNAo4)将沉淀(即结合了 ssDNA的细菌)溶于100 y L I XPCR缓冲液中，94°C热变性8min,立即冰浴IOmin,将结合上的ssDNA从细菌上解离下来。5)5000g 4°C离心5min取上清，此为第一轮与细菌结合的ssDNA，将其作为模板进行PCR扩增，扩增产物用作第二轮的筛选。扩增体系为RoundI ssDNA 2yL，引物 II 5 ii L，含 Mg2+的 dNTP I ii L，Taq 酶0. 5u L, 10XPCR buffer 5 y L，用无菌超纯水补足 50 y し① 94 °C 5min，② 94 °C 45s，③ 55で 45s，④ 72で 45s，⑤ go to ②，2times，⑥ 72で lmin ⑦ 12で 2min ⑧ end。所得 PCR产物作为 Round2 模板，Round 2 :模板 I y L，引物1、II 各 I y L，含 Mg2+ 的 dNTP I u L，Taq酶 0. L，10XPCR buffer 5 y L，用无菌超纯水补足 50 y し① 94°C 5min，② 94°C 45s，③ 55°C 45s，④ 72°C 45s，⑤ go to ②，30times，⑥ 72°C lmin ⑦ 12°C 2min ⑧ end。6)重复筛选重复上述筛选过程，共进行9轮筛选。7)富集寡核苷酸适配子文库的测序结果与分析a.将最后的富集文库扩增为双链，连接pUC19-T载体，转化E. coli DH5 a，从90个克隆中随机挑取26个阳性克隆进行DNA序列测定(分别命名为VP1-VP26)。b.采用DNAMAN软件对30条序列进行同源性分析，RNAstructure软件对30条序列进行高级结构分析。c.结合软件分析本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种特异性识别副溶血性弧菌的寡核苷酸适配子及其筛选方法与应用，其特征在于：所述寡核苷酸适配子的序列如序列表中所示。
【技术特征摘要】
1.一种特异性识别副溶血性弧菌的寡核苷酸适配子及其筛选方法与应用，其特征在于所述寡核苷酸适配子的序列如序列表中所示。2.根据权利要求1所述的特异识别副溶血性弧菌的寡核苷酸适配子的筛选方法，按照下列步骤进行1)随机单链DNA(ssDNA)文库的构建和引物随机 ssDNA 文库5’ -ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-N40-TATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3’引物1:5’ -ATAGGAGTCACGACGACC...
【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，段诺，吴世嘉，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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