一组特异识别伏马菌素B1的寡核苷酸适配子制造技术

本发明专利技术提供了一组伏马菌素B1的单链DNA核酸适配子，是通过SELEX技术结合表面固定了伏马菌素B1的磁珠对原始单链DNA随机文库进行筛选、扩增、测序、亲和力及特异性分析得到的。该组DNA适配子作为伏马菌素B1的一种特异高效识别配体，为开发替代现有依赖抗体检测伏马菌素B1的方法提供了新的选择，可用于分析检测或分离富集食品、环境中的伏马菌素B1。所述核酸适配子分子量小，化学合成成本低且易于标记，亲和性和特异性强，变性与复性可逆且速度快，可反复使用、室温运输和长期保存。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一组特异识别伏马菌素BI的寡核苷酸适配子及其制备方法，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)·制备一组特异结合伏马菌素BI的寡核苷酸适配子，属于生物

技术介绍
·伏马菌素(Fumonisins)是串珠镰刀菌在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的水溶性次级代谢产物，在全世界范围内分布广泛，主要污染粮食作物及饲料尤其对玉米及其制品污染严重，还可存在于以谷物为原料的一些产品中，如面条、啤酒、调味品等。伏马菌素的热稳定性高，不易被破坏，对人畜具有神经毒性、肺毒性等多种毒性及致癌性，主要损伤肝脏和肾脏，严重危害人类和动物的健康。国际癌症研究院(The International Agencyfor Research onCancer)已将伏马菌素定为2B组致癌物质(可能是人类致癌物)，其中伏马菌素BI的毒性强且污染率高。加入WTO之后，农产品及相关食品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品生物安全性的要求也越来越高。为了保证这类产品的顺利进出口贸易和食用者的健康，出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门迫切需要一种特异、快速、简便的伏马菌素BI检测方法。目前伏马菌素BI的测定方法有多种，如薄层层析法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC/MS)、毛细管电泳法(CE)、液相色谱-质谱法(LC/MS)和酶联免疫测定法(ELISA)等方法。薄层层析法操作简单，适合于没有经过专门培训的人员操作，且成本低，无需价格昂贵的仪器；但其步骤较繁琐，灵敏度低。HPLC法准确度高，灵敏度性强，可作为定量检测方法，但是这种方法前处理过程繁琐，操作复杂，在实验时需要对伏马菌素进行柱前衍生化处理，而且通常需要专业人员进行操作，仪器设备昂贵，检测过程耗时且费用较高，不适于在基层推广及大量样品的现场快速检测。ELISA法特异性强，灵敏度高，准确性好，操作简便，适于大批量样品的检测；但检测的灵敏度和试剂盒的稳定性方面离实际应用还有一定的距离，此外免疫法需依赖于制备繁琐耗时且成本昂贵的抗体，且制得的抗体批次间稳定性不如寡核苷酸，抗体的储存条件也较寡核苷酸严苛。近些年来，寡核苷酸适配子作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注目。寡核苷酸适配子是通过SELEX过程筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA 片段。SELEX 技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment,系统进化指数富集技术)是20世纪90年代发展起来的一种新的组合化学技术，具有经济、简便、快速、适用范围广等特点。SELEX技术利用大容量的随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，使其得到指数级富集，经过多轮筛选最终获得高亲和力、高特异性的寡核苷酸适配子。与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸随机文库中筛选出的适配子具有很多优势(I)寡核苷酸分子本身分子量很小，其化学结构和性质提供了易于标记的特性，易于合成及化学修饰使之便于后续试验；(2)不依赖于动物体内免疫，不存在抗体由于不同批次生产带来的差异性；(3)某些寡核苷酸适配子具有强于抗体的亲和性和特异性，无免疫原性；(4)核苷酸稳定性好，易于保存和运输，对高温和剧烈环境不如抗体敏感。本专利技术以食品及环境中常见的伏马菌素BI为靶标，利用竞争SELEX技术制备获得了与伏马菌素BI高特异性高亲和力结合的寡核苷酸适配子。该寡核苷酸适配子经修饰后可直接用于荧光或化学发光、发色方法检测伏马菌素BI以丰富实验室检测手段，也可用于开发伏马菌素BI试纸条或便携式小型仪器以实现家庭、农田、工厂快速检测，因此该专利技术可以在食品安全检测、环境监测等领域得到广泛应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能与伏马菌素BI特异性结合的寡核苷酸适配子并用于快速、准确检测伏马菌素BI，为开发新型伏马菌素BI分析方法或检测工具奠定良好基础。本专利技术采用以下技术方案体外合成一个长度为80nt的含40个随机序列的单链DNA文库，以及长度均为20nt的上下游引物及磷酸化下游引物；优化PCR条件及Lambda核酸外切酶消化磷酸化反义链制备单链次级文库的条件；将伏马菌素BI通过戊二醛二步偶联法固定在磁珠上作为筛选靶标，采用竞争SELEX技术筛选出具有高亲和力的伏马菌素BI寡核苷酸适配子；通过DNAMAN软件分析序列同源性将测序所得序列分为11个家族，并通过结构预测软件RNAStructureProgram分析预测寡核苷酸适配子的二级结构；合成生物素标记的11条寡核苷酸适配子，通过与伏马菌素BI磁珠的结合试验分析寡核苷酸适配子的亲和力，以及与链霉亲和素磁珠的竞争结合解离试验鉴定寡核苷酸适配子的特异性。本专利技术的优点(I)以Lambda核酸外切酶消化磷酸化反义链制备单链次级文库，克服了变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳、非对称PCR或借助链霉亲和素磁珠分离单链方法中存在的操作繁 琐、耗时长、效率低或易引入背景污染(如双链DNA模板、生物素化互补链或链霉亲和素分子)等不足，使其制备的ss DNA具有更高的纯度和效率。(2)获得了能与伏马菌素BI高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸适配子，为进一步开发伏马菌素BI的新型分析方法或检测工具奠定了基础。(3)因为是通过SELEX技术获得的小分子寡核苷酸适配子，本专利技术具有制备方法简单、周期短、无需动物体内免疫，且寡核苷酸适配子的合成简便、易于标记、稳定性好、成本低廉等优点，相对于抗体的优势显而易见。附图说明图图图表表I是Lambda核酸外切酶消化制备单链次级文库的变性PAGE电泳2是伏马菌素BI寡核苷酸适配子11个家族代表序列的二级结构分析图3是伏马菌素BI寡核苷酸适配子1F、3F及8F的特异性试验结果I是SELEX筛选过程中每一轮筛选条件的说明；2是伏马菌素BI寡核苷酸适配子11条代表序列的解离常数Kd值。具体实施例方式以下结合说明书附图和实施例对本专利技术作进一步的说明，但不是限制本专利技术。实施例1 :伏马菌素BI特异性结合寡核苷酸适配子的竞争SELEX筛选1、体外化学合成初始随机单链DNA(ssDNA)文库及引物(由美国IDT公司完成)序列如下5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG(40N)CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3' (40N代表40个随机核苷酸);上游引物5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3'下游引物5'-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3' 5'磷酸化下游引物5' -P-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'将随机ssDNA文库和引物均用TE缓冲液配制成100 μ M贮存液存于_20°C备用。2、PCR扩增条件及Lambda核酸外切酶消化制备单链次库的条件将合成的随机单链文库(ssDNA)稀释作为PCR模板扩增出磷酸化的双链DNA(dsDNA)产物，研究Lambda核酸外切酶消化磷酸化反义链制备单链次库的影响因素，最终确定制备单链次库的最佳条件。PCR反应体系为稀释随机文库作为模板DNAl μ L(IOOng)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组特异识别伏马菌素B1的寡核苷酸适配子，其核苷酸序列为：1)序列表1～3所示的核苷酸序列；2)序列表1～3所示核苷酸序列经替换、缺失和/或者插入一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的序列；或，3)含有序列表1～3所示核苷酸序列为核心序列并两边延长的序列。

【技术特征摘要】
1.一组特异识别伏马菌素BI的寡核苷酸适配子，其核苷酸序列为1)序列表I 3所示的核苷酸序列；2)序列表I 3所示核苷酸序列经替换、缺失和/或者插入一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的序列；或，3)含有序列表I 3所示核苷酸序列为核心序列并两边延长的序列。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，陈秀娟，段诺，吴世嘉，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：