本发明专利技术属于医药制备领域，特别涉及脂联素在制备治疗老年缺血性脑卒中药物中的应用，本发明专利技术采用缺血/再灌注小鼠模型，通过AAV载体基因治疗，将脂联素分别转染至老年小鼠、成年小鼠脑内，使脂联素在小鼠脑内局部高表达。tMCAO造模，观察脂联素对老年小鼠及成年小鼠脑后缺血后脑萎缩程度、血管新生、神经变化等的影响。结果表面：脂联素对老年小鼠脑缺血后脑萎缩的改善效果比成年小鼠更显著，具有抗缺血的脑保护作用；脂联素对老年小鼠神经学功能的恢复效果明显；脂联素可促进老年小鼠脑缺血区域血管生成；脂联素对促进老年组小鼠脑内动脉增生效果显著；脂联素对老年小鼠脑缺血后神经发生促进作用较成年小鼠更显著。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药制备领域，特别涉及脂联素在制备治疗老年缺血性脑卒中药物中的应用。
技术介绍
缺血性脑卒中是严重威胁人类健康的常见病、多发病，具有发病率高、致残率高、死亡率高的特点。目前缺血性脑卒中已成为西方发达国家仅次于癌症和心血管疾病的第三大主要死因，占全球死因10%;而我国第三次国民死因调查结果显示，脑卒中已上升成为我国第一位死因。每年新发脑卒中约200万人，死于脑卒中约有150万，75%存活者伴有不同程度的残疾。卒中致残和致死的危害给社会和家庭造成沉重的经济和心理负担。尽管脑卒中可发生于各个年龄段，但随着年龄增加脑卒中发病率显著升高。老龄是缺血性脑卒中最重要的危险因素。研究发现，55岁以后，脑卒中发病率以指数方式成倍增长；75-89%脑卒中患者发病在65岁以上，50%患者发生在70岁以上，约25%发生在85岁以上。随着当今社会人口结构老龄化进程的加快，老年缺血性脑卒中发病率将进一步升高，脑卒中已成为老年人致死的重要病因。脂联素是脂肪组织分泌的一种特异性细胞因子，具有增加胰岛素敏感性、抗炎、抗动脉粥样硬化的特点。脂联素在血循环中浓度较高，通过与脂联素受体(adiponectinreceptor)结合发挥生物学作用，脂联素受体存在两种即AdipoRl、AdipoR2。由于其具有抗糖尿病、抗动脉粥样硬化、抗炎、抑制肿瘤生长等特性，成为国内外学者研究的热点。衰老可直接影响脂肪因子的分泌，造成脂联素分泌异常。中年以后，脂肪重新分布导致的腹型肥胖可致多种脂 肪因子分泌紊乱，脂联素表达下调，瘦素、IL-6、TNF-α及抵抗素等过度生成，造成系统性炎症反应及胰岛素抵抗。老年时期，脂肪代谢障碍和脂肪萎缩引起脂肪因子分泌异常，引发或促进胰岛素抵抗。动物学实验证实，快速老化小鼠(SAPPjn^)的脂联素水平明显低于对照 组小鼠。临床上对老年人脂联素水平的观察结果并不一致，目前尚未证实脂联素与年龄有显著相关性。脂联素水平与脑卒中严重程度呈负相关，与脑卒中死亡率及致残率密切相关，老年缺血性脑卒中比年轻患者愈后更差，而卒中后脑内脂联素的表达高低是否与愈后相关，目前这方面的研究仍是空白。现有的文献也没有记载脂联素在治疗老年缺血性脑卒中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供脂联素在治疗老年缺血性脑卒中药物中的新用途，为临床上更合理的将脂联素(以下简称APN)用于老年缺血性脑卒中的治疗及治疗的时间靶点提供合理实验数据和科学依据。本专利技术涉及脂联素在制备治疗老年缺血性脑卒中药物中的应用。本实验采用缺血/再灌注小鼠模型，通过AAV载体基因治疗，将脂联素分别转染至老年小鼠、成年小鼠脑内，使脂联素在小鼠脑内局部闻表达。tMCAO造I旲,观察脂联素对老年小鼠及成年小鼠脑后缺血后脑萎缩程度、血管新生、神经变化等的影响；比较老年小鼠、成年小鼠脑缺血的神经功能学改变，而后进一步观察老年小鼠、成年小鼠脑缺血后脂联素的表达时程、表达部位，从而可评估脂联素与老年缺血性脑损伤中的关系，得出脂联素在老年小鼠脑缺血性脑卒中的治疗效果，为临床上合理使用脂联素提供实验数据。本专利技术具有以下优点1、脂联素对老年小鼠脑缺血后脑萎缩的改善效果比成年小鼠更显著，具有抗缺血的脑保护作用；2、脂联素对老年小鼠神经学功能的恢复效果明显；3、脂联素可促进老年、成年小鼠脑缺血区域血管生成，而且脂联素治疗的老年小鼠缺血后血管生成比成年小鼠治疗后更多；4、脂联素对促进老年组小鼠脑内动脉增生效果显著；5、脂联素对老年小鼠、成年小鼠脑缺血后均有促进神经发生的作用，且对老年小鼠脑缺血后神经发生促进作用较成年小鼠更显著，神经发生的促发作用对脂联素改善脑缺血神经功能亦非常关键。附图说明图1是AAV-GFP转染后GFP在老年组、成年组小鼠大脑中的表达图。图2是AAV-APN转染后APN在老年组、成年组小鼠大脑中的表达图。图3是AAV-APN定位注射后APN蛋白在老年组、成年组小鼠大脑中的表达图。图4是转染AAV-APN后APN在缺血脑组织中的表达图。图5是过表达APN减轻老年组、成年组小鼠缺血后脑萎缩的测试图。图6是老年组、成年组小鼠经APN治疗后脑缺血后mNSS评分图。图7是老年组、成年组小鼠经APN治疗后平衡木行走时间测试图。图8是老年组、成年组小鼠经APN治疗后转棒行走时间测试图。图9是老年组、成年组小鼠经APN治疗后转角实验结果图。图10是tMCAO手术后2周，老年组、成年组缺血脑组织微血管图。图11是tMCAO手术后4周，老年组、成年组缺血脑组织微血管图。图12是tMCAO手术后4周，老年组、成年组缺血脑组织动脉密度图。图13是tMCAO手术后2周，老年组、成年组SVZ区神经变化图。具体实施例方式下面结合实施例，对本专利技术作进一步说明实验用的小鼠模型本次实验中，采用清洁级雄性CD-1成年小鼠30只，年龄10-12周，体重25-30g，清洁级雄性CD-1老年小鼠30只，年龄20-24月，体重45_50g，均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，以上小鼠在人工控制的昼夜节律光环境中饲养，小鼠的饮水与饮食不受任何限制。实验用的基因载体携带脂联素(以下简称APN)治疗基因的2型重组腺相关病毒载体rAAV2-APN (以下简称A AV-APN)，空白对照载体rAAV2_EGFP (以下简称AAV-GFP)，两种载体均购自本元正阳基因技术有限公司，两种载体均含有CMV启动子，病毒滴度均为4.3 X1011 (vector genomes)/mL。1、小鼠大脑立体定位载体注射将小鼠分成AAV-APN转基因老年组、AAV-GFP转基因老年对照组、AAV-APN转基因成年组、AAV-GFP转基因老年对照组共四组。应用氯胺酮/赛拉嗪(100/10mg/kg)腹腔注射麻醉上述四组小鼠，麻醉成功后固定于脑立体定向仪上。碘伏消毒小鼠头部的皮肤，行头顶部正中手术切口，长约Icm,暴露前囟，于前囟后1_、旁开中线2mm为定位点，电钻磨开颉骨直到显露硬膜。将IOul微量注射器固定于立体定向仪，在注射定位点上方垂直进针，以微螺旋定量推进器匀速缓慢注射病毒载体，其中向脂联素治疗组注射病毒载体为rAAV2-APN，注射量为5ul (4X109v. g.)，向空白对照组注射病毒载体为rAAV2-GFP，注射量为5ul (4X109v. g.)，注射速率为O. 2ul/min0注射完毕待15min后缓慢拔针。骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合皮肤。接受AAV-APN、AAV-GFP定位注射的各组动物术后均未出现神经功能缺损体征、皮毛正常，进食无异，体重无减轻，未发生动物死亡。证明脑室内注射rAAV2载体对动物的生理状况无明显影响，安全可行。2、定位注射后各组小鼠接受tMCAO手术在大脑立体定位注射载体后7天，四组小鼠行tMCAO术。小鼠称重，将小鼠面罩扣于口鼻部，连接麻醉气体，手术显微镜下做颈部正中切口，暴露胸骨舌骨肌后，钝性分离颌下腺，暴露左侧胸锁乳突肌和二腹肌，先后分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，分别依次结扎，在颈外动脉另栓一根丝线，只打虚结不系紧。剪断颈外动脉远端，将栓线从颈外动脉处逆行插向颈总动脉的分叉处，将栓线转至与颈内动脉平行，轻缓地将栓线小心经颅内段颈内动脉插入至感到轻微阻力，此时栓线头端大致已经通过大脑中动脉开本文档来自技高网...
【技术保护点】
脂联素在制备治疗老年缺血性脑卒中药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.脂联素在制备治疗老年...
【专利技术属性】
技术研发人员：宁光，缪婕，沈琳辉，赵咏桔，
申请(专利权)人：上海市内分泌代谢病研究所，
类型：发明
国别省市：
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