一种抗肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种抗肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途，其氨基酸序列为SEQ.ID.NO:1所示。所述EFB的制备方法还是首先获得编码有上述融合蛋白的DNA。本发明专利技术所述药品制剂可用于治疗肾癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，前列腺癌，卵巢癌，神经胶质瘤，头颈癌，乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胧癌、前列腺癌、直肠结肠癌、子宫颈癌、和脑瘤等各种肿瘤。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA重组技术和医药制药领域，具体地说是涉及与人表皮生长因子受体密切关联的一种抑肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途。
技术介绍
恶性肿瘤是威胁人类健康与生命的重大疾病之一，其发病率和死亡率逐年升高，而目前临床仍然缺乏非常有效的药物。近年来研究发现肿瘤的发生往往是由肿瘤细胞对凋亡抵抗所致，同时细胞凋亡机制发生异常。因此如何调控细胞凋亡成为了当今抗肿瘤药物研究中的重要课题。在细胞凋亡研究中人们发现，Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡通路的关键蛋白分子。Bcl-2家族至少包含17个以上成员。按照其结构与功能上的不同，Bcl-2家 族可以分为 3 组①抗凋亡(antiapoptotic orprosurvival)家族，包括 Bcl_2、Be1-XL >Mcl-U Bcl-w和Al，它们均含有4个BH结构域(BH1-4);②含有多个BH结构域促凋亡(pro-apoptotic)家族,包括Bax和Bak ;③唯BH3域结构促凋亡家族,它们仅含有与Bcl_2同源的 BH3 结构域，包括 Bad、Bid、Bik、Bim、Bmf、Hrk, Noxa、PUMA 和 Beclin-10 唯 BH3 结构域蛋白是凋亡作用的效应分子，其惟一的已知结构域BH3是其促凋亡功能的关键效应结构。抗凋亡Bcl-2家族蛋白和促凋亡Bcl-2蛋白家族成员之间发生失衡是引发肿瘤发生的重要原因和标志性事件。当Bcl-2抗凋亡家族蛋白在细胞中有过度表达时，使得细胞的凋亡过程受阻，从而导致肿瘤发生。随着细胞凋亡研究的深入，人们发现Bcl-2家族蛋白的BH3结构域在线粒体介导的细胞凋亡过程中亦发挥着重要的作用。Bcl-2家族促凋亡蛋白在细胞凋亡信号刺激下活化，其通过BH3结构域结合Bcl-2抗凋亡蛋白，由此形成二聚体，从而拮抗了抗凋亡蛋白的活性，由此促使肿瘤细胞凋亡。基于这些研究成果，许多小分子BH3模拟物如SAHB-BID，Cpm-1285, ABT-737, Obatoclax等多种肿瘤抑制剂已经进入临床前和临床试验阶段。实验表明，这类抑制剂可与某些抗凋亡蛋白相互作用，拮该抗凋亡蛋白功能。但是这类药物开发中也发现，仅抑制肿瘤细胞中一种或几种Bcl-2抗凋亡蛋白，其抗肿瘤效果并不十分理想。如ABT-737只能有效的结合Bcl-xL，Bcl-2和Bcl_w，并不能结合Mcl-1，这样就会导致肿瘤细胞对ABT-737产生抗性；反义核酸Genasense在联合化疗治疗多肿瘤时疗效欠佳。另外，也有研究表明，即使设计的分子BH3结构域模拟物如TW37可以所有类型的Bcl-2抗凋亡家族发生反应，其单独应用的疗效仍不尽如人意，因此，在应用时仍需与其他抑制剂协同用药。目前，小分子BH-3模拟物类抑制剂还存在的问题有(I)小分子BH-3模拟靶向特异性差，其不只会进入肿瘤细胞，同样也会进入到正常细胞内。(2)现有的BH3肽段细胞透过性以及生物利用度均较低，结构的可溶性和代谢的稳定性也有待进一步完善。在肿瘤细胞学研究中人们还发现表皮生长因子受体(EGFR)在许多肿瘤细胞(胃癌、乳腺癌、膀胱癌和头颈部鳞癌)中都有过度表达。表皮生长因子受体EGFR正常情况下主要表达在表皮细胞和间充质细胞系，其配体包括EGF、TGFa、HB-EGF等。EGFR本身具有酪氨酶激酶活性，一旦与表皮生长因子(EGF)组合可启动细胞核内的有关基因，从而促进细胞分裂增殖。当EGFR过度表达时，常常会导致肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及抗凋亡。EGFR 过度表达常常预示着无病生存期和总生存期下降、复发及远处转移的风险增加。因此，针对 EGFR靶向治疗，阻断EGFR信号传导通路，亦是抗肿瘤药物研究的重要方向之一。目前，有研究人员将抗EGFR抗体或EGF与强效的细胞毒素如白喉毒素、蓖麻毒素和天花粉蛋白藕联后与EGFR结合，由此诱导细胞凋亡。也有研究人员通过细胞杀伤因子、放射性粒子等来选择性杀死富含EGFR肿瘤细胞。但这些方法的靶向特异性尚待进一步改善。本专利技术的目的有以下几个方面第一是提供一种具有双靶向、特异性好、并可有效抑制肿瘤细胞的抗肿瘤融合蛋白；第二是提供一种编码有所述抗癌融合蛋白的DNA ；第三是提供一种含有所述抗癌融合蛋白DNA的载体；第四是提供所述抗肿瘤融合蛋白在制备抑制肿瘤药物中的应用；第五是提供一种含有所述抗肿瘤融合蛋白的药物组合物。 第六是提供一种制备所述抗肿瘤融合蛋白的方法。本专利技术的第一方面通过以下方式实现的本专利技术所提供的抗肿瘤融合蛋白的名称为抗肿瘤融合蛋白EFB (简称EFB)，其氨基酸序列为SEQ.1D. NO:1所示。其包括有a、EGF氨基酸序列；b、BID含BH3结构域的蛋白的部分或者全长氨基酸序列；c、EGF氨基酸序列与含BH3结构域的蛋白的部分或者全长氨基酸序列选用Furin 敏感位点连接。本专利技术可在不改变EGF进入细胞功能的情况下，添加不同的氨基酸序列使得它有不同的细胞定位如定位到内质网，线粒体，溶酶体囊泡等。本专利技术所述含BH3结构域的蛋白为Bcl-2促凋亡家族中的Bid。本专利技术是将EGF基因与含BH3结构域的蛋白基因通过连接肽(绿脓杆菌外毒素 A(TRHRQPRGWE, Fpe))进行融合的。由此构成兼具EGF、BH3结构域两者生物功能的融合蛋白。其中EGF与BH3结构域也可以直接连接。本专利技术所述EFB可通过基因重组技术获得，即首先获得编码有上述融合蛋白的 DNA。DNA的获得可以通过常规技术，如PCR合成，化学合成等方法，使用酶切的技术被克隆到载体中。所用载体可以是分子生物学所常用的质粒、病毒或DNA片断。载体序列中包含适合重组蛋白表达的所有原件如驱动基因表达的增强子和启动子，蛋白质翻译起始和终止信号，以及多聚腺苷酸序列等表达原件。载体中有抗菌素抗性基因以利于质粒在细菌中所繁殖。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因用于稳定转染细胞株的选择。在完成上列各种融合蛋白的质粒构建以后，即可用质粒DNA转染细胞，表达相应的蛋白质。能够用于表达这些融合蛋白的表达系统有多种，它们包括(但不限于)哺乳动物细胞，细菌，酵母，昆虫细胞，等等。编码重组蛋白的质粒可经转染((transfection)进入细胞。转染细胞的方法有多种，其中包括(但不限于)电转(electroporation),脂质体 (liposome)介导，|丐介导，等等。本专利技术所述EFB进行拼接时，连接肽的设计可按照本领域中的常规方法进行设计(如参见 Hudson PJ, Recombinant antibody fragments. CurrentOpinion in Biotechnology,1998, 3:279-299.Gary Thomas.Furin at the cuttingedge: From protein traffic to embryogenesis anddisease. Nat Rev Mol CellBiol. 2002, 3(10) :753 - 766)。本专利技术第二方面通过以下方式实现编码有本专利技术所述抗癌融合蛋白的DNA，其核苷酸序列如SEQ.1D. NO:2所示。 该编码DNA可以化学合成，也可以通过常规技术的PCR扩增、酶切被克隆到载体中。本专利技术第三方面通过以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗肿瘤融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ.ID.NO:1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈川，杨润蕾，罗都强，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：