本发明专利技术属于维生素C生物发酵技术领域，具体的说是Vc第二步生物发酵中一种利用混合菌生物发酵转化山梨糖为2-酮基-L-古龙酸的方法。Vc二步发酵生产工艺的种子液逐级扩大，发酵培养时将A菌系和B菌系的种子液，以体积百分比15-20％的总接种量接入发酵罐中发酵培养至发酵终点（即至发酵液中残余山梨糖浓度≤1mg/ml），实现利用混合菌发酵转化山梨糖为2-酮基-L-古龙酸;其中A菌系由伴生菌蜡样芽孢杆菌/伴生菌巨大芽孢杆菌与产酸菌生酮基古龙酸菌组成；B菌系由伴生菌苏云金芽孢杆菌和产酸菌生酮基古龙酸菌组成；采用本发明专利技术的三菌混合发酵新方法，发挥了两种伴生菌的各自优势，可缩短发酵周期6-8小时，降低能耗10-15％，提高发酵转化率2-4％。
【技术实现步骤摘要】
一种利用三种菌混合发酵转化山梨糖2-酮基-L-古龙酸的方法
本专利技术属于维生素C生物发酵
，具体的说是Vc第二步生物发酵中一种利用混合菌生物发酵转化山梨糖2-酮基-L-古龙酸的方法。
技术介绍
Vc 二步发酵的工业化生产，其第二步发酵为两种菌的混合发酵，实现从L-山梨糖到2-酮基-L-古龙酸的生物转化。两种菌包括具有产酸能力的细菌-普通生酮基古龙酸菌(俗称产酸菌或小菌)和不具有转化产酸能力但却能促进小菌生长和产酸的伴生菌(俗称大菌)。已有研究结果表明，普通生酮基古龙酸菌单独培养传代存活率及产2-酮基-L-古龙酸能力均较弱，只有与伴生菌混合培养时才能快速生长和产酸。但是，伴生菌的种类、数量和生长特性对小菌的生长和产酸具有重要影响，进而改变着维生素C第二步发酵的效率。目前，生产上应用的伴生菌主要有蜡状芽孢杆菌(Bacills cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽抱杆菌(Bacillsthuringiensis)等，且仅用其中一种伴生菌与产酸菌搭配进行两种菌的混合发酵产酸。因为一株伴生菌的高效伴生能力持续时间较短，难以在发酵的整个阶段持续提供充足的效应物，所以，产酸菌的产酸能力在发酵过程中无法长期保持在最佳状态，使得第二步混菌发酵的效率难以得到有效提高。另外，由于检测结果的滞后和种子液多级扩大过程的复杂，二步混菌发酵的大罐常出现染菌和染噬菌体的现象，噬菌体杀死伴生菌，使得伴生因子不能满足产酸菌生长和发酵产酸，导致发酵速度明显降低甚至发生放罐情况，严重影响了古龙酸的产量，并造成大量能耗和材料损失。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种利用三种菌混合发酵转化山梨糖2-酮基-L-古龙酸的方法。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为—种利用三种菌混合发酵转化山梨糖2-酮基-L-古龙酸的方法Vc 二步发酵生产工艺的种子液逐级扩大，发酵培养时将A菌系和B菌系的种子液，以体积百分比15-20%的总接种量接入发酵罐中发酵培养至发酵终点(即至发酵液中残余山梨糖浓度< lmg/ml)，实现利用混合菌发酵转化山梨糖为2-酮基-L-古龙酸；其中A菌系由伴生菌蜡样芽孢杆菌/伴生菌巨大芽孢杆菌与产酸菌生酮基古龙酸菌组成菌系由伴生菌苏云金芽孢杆菌和产酸菌生酮基古龙酸菌组成。所述A菌系和B菌系的种子液按体积比2:1 10:1的比例混合接入发酵罐。将所述两种菌系分别加入到发酵罐中，两种先后加入的菌系在20小时内接种到发酵罐中使总接种量达到15-20%。所述在Vc 二步发酵过程中A菌系和B菌系经过连续三级种子扩大培养，继而得到的三级种子液再接种于发酵罐；其中A菌系和B菌系连续三级种子扩大培养分别为以体积比1-5%、5-10%和5-10%的接种量分别作为三级种子扩大培养的各级接种量，同时各级培养温度为27-31 °C，发酵时间在6-14小时，通风量为1:0.8-1.0 (溶氧比为25-30%);每级种子达到种液中古龙酸含量达3. 0-10. Omg/ml,转种到下一级。将连续扩大培养的A菌系和B菌系的三级种子液接种于发酵罐中，在27_31°C、罐压O. 005-0. 02Mpa, pH 6. 0-8. O下进行发酵培养，发酵过程中流加L-山梨糖，直至发酵液中残余山梨糖浓度彡lmg/ml，从而实现利用混合菌发酵转化山梨糖为2-酮基-L-古龙酸。所述发酵过程中间断或连续的流加底物L-山梨糖，流加速率为2-10m3/小时，至发酵液中山梨糖终浓度达7-10mg/ml。本专利技术具有如下优点I.本专利技术实现三菌混合发酵转化山梨糖为2-酮基-L-古龙酸，可缩短发酵周期 6-8小时，降低能耗10-15%，提高发酵转化率2-4%。2.本专利技术的工艺简便，不需要添置大型设备，也不需要对现有设备进行过多改造。3.本专利技术实现Vc 二步发酵的三菌混合培养，两种伴生菌可提供持续有效的伴生效应物，从而使小菌生长和产酸处于最佳状态，杜绝了二步发酵过程中因效应物不足出现小菌产酸效率不高的现象，使其发酵转化得以持续高效进行。4.本专利技术的三菌混合培养，其中两种伴生菌的生长和繁殖特性不同，A菌系前期生长快，B菌系后期生长快，两种伴生菌共同培养，可以有效弥补在发酵过程中因一种伴生菌数量不足而导致的发酵效率低下。5.本专利技术的三菌混合发酵，两种伴生菌同时存在于发酵液中，增强了发酵过程中对染噬菌体的抗性，减少了因染噬菌体而放罐的现象，提高了发酵效率。6.本专利技术基于Vc 二步发酵伴生菌与产酸菌的相互作用机理及各自生长和代谢特性的差异，采用不同发酵菌系种液按比例共同接入大罐发酵的模式，完成2-酮基-L-古龙酸的高效发酵。具体实施方式实施例I从斜面种液中分别取由蜡样芽孢杆菌和生酮基古龙酸菌组成的A菌系和由苏云金芽孢杆菌和生酮基古龙酸菌组成的B菌系，分别以5% (体积比)作为三级连续扩增的种液的接种量，分别接种于不同等级的种子培养基中(种子培养基，按重量百分比计蛋白胨O.3%，牛肉膏 O. 3%，酵母膏 O. 3%，玉米浆 O. 3%，MgS04 O. 01%,FeSO4 O. 01%，L-山梨糖 2%, pH 7.0,琼脂2. 5%，余量为水；121°C高温灭菌20min;待用。)，分别摇瓶培养20小时至不同等级发酵液中古龙酸产量在8-10mg/ml,转种到下一级；在上述种子液经三级扩大培养后，分别取A种子液2. 4ml和B种子液O. 8ml,共 3. 2ml接入装有20ml发酵培养基(培养基配方按重量百分比计玉米浆，I. 5%，尿素I. 2%， 山梨糖8%, MgSO4 O. 01% ,蒸懼水定容至1000ml,调节pH至7. 0,121°C高温灭菌20min) 的三角瓶中，以29°C，罐压O. 005-0. 02Mpa, 150转/分下振荡培养38小时，发酵过程中流加 L-山梨糖，直至发酵液中残余山梨糖浓度彡lmg/ml，从而实现利用混合菌发酵转化山梨糖为2-酮基-L-古龙酸。最终发酵液中古龙酸值达68. Omg/ml，转化率达94.4%。实施例2-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用三种菌混合发酵转化山梨糖2?酮基?L?古龙酸的方法,其特征在于：Vc二步发酵生产工艺的种子液逐级扩大，发酵培养时将A菌系和B菌系的种子液，以体积百分比15?20％的总接种量接入发酵罐中发酵培养至发酵终点（即至发酵液中残余山梨糖浓度≤1mg/ml），实现利用混合菌发酵转化山梨糖为2?酮基?L?古龙酸;其中A菌系由伴生菌蜡样芽孢杆菌/伴生菌巨大芽孢杆菌与产酸菌生酮基古龙酸菌组成；B菌系由伴生菌苏云金芽孢杆菌和产酸菌生酮基古龙酸菌组成。
【技术特征摘要】
1.一种利用三种菌混合发酵转化山梨糖2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于Vc二步发酵生产工艺的种子液逐级扩大，发酵培养时将A菌系和B菌系的种子液，以体积百分比15-20%的总接种量接入发酵罐中发酵培养至发酵终点(即至发酵液中残余山梨糖浓度(lmg/ml),实现利用混合菌发酵转化山梨糖为2-酮基-L-古龙酸； 其中A菌系由伴生菌蜡样芽孢杆菌/伴生菌巨大芽孢杆菌与产酸菌生酮基古龙酸菌组成菌系由伴生菌苏云金芽孢杆菌和产酸菌生酮基古龙酸菌组成。2.按权利要求I所述的利用三种菌混合发酵转化山梨糖2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于所述A菌系和B菌系的种子液按体积比2:1 10:1的比例混合接入发酵罐。3.按权利要求I所述的利用三种菌混合发酵转化山梨糖2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于将所述两种囷系分别加入到发酵te中，两种先后加入的囷系在20小时内接种到发酵罐中使总接种量达到15-20%。4.按权利要求I或3所述的利用三种菌混合发酵转化山梨糖2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于所述在Vc 二步发酵过程中A菌系和B菌系经过连续三级...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨伟超，徐慧，满都拉，张忠泽，安海英，胡昊，李英杰，韩利涛，姜铭妍，谌明，徐静，曹桂环，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：
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