本发明专利技术提供了单分散聚甲基丙烯酸酯强阳离子交换层析介质在胸腺五肽纯化中的应用，所述应用方法采用单分散聚甲基丙烯酸酯强阳离子交换层析介质为填料的色谱柱进行柱层析。本发明专利技术采用单分散聚甲基丙烯酸酯强阳离子交换层析介质为填料的色谱柱进行柱层析，不但利于以水溶液做流动相分离纯化胸腺五肽粗品，达到高纯度和高回收率，而且柱层析不会随着盐浓度和流速的变化而发生变化，层析填料可耐高压和高流速、并具备高载量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物纯化领域，特别是一种胸腺五肽的纯化方法。
技术介绍
胸腺五肽(Thymopent in, TP5)是促胸腺生成素32 36上5个氨基酸组成的小肽，TP5的分子式是C3tlH49N9O9，相对分子质量679. 41，等电点是9. 9，化学式是NH2 - Arg -Lys - Asp - Val - Tyr - 0H，它保留了胸腺生成素的有效生物活性，有调节和增强人体细胞免疫功能的作用，临床上主要用于治疗肿瘤、单纯疱疹、类风湿性关节炎、艾滋病、严重免疫缺陷综合症、慢性乙型肝炎等，其注射用药剂是目前世界上处方量处于第一位的免疫调节剂。胸腺五肽在医用上良好的产业前景使得人们将注意力纷纷集中在大规模生产上，由于其分子式简单的特点使固相化学合成法独具优势，成为获得胸腺五肽的重要途径， 目前报道的胸腺五 肽后期纯化方法主要集中在使用反相层析及离子交换。南京工业大学学报2005年第27第二期13-17页阐述了高纯度胸腺五肽的分离和纯化方法，使用强阳离子交换层析介质SP Sepharose FF为层析介质纯化胸腺五肽，粗品载量为3. 75mg/mL，最后制得色谱纯度大于98. 23%的胸腺五肽回收率为67. 03%。虽然该方法得到的产品纯度较高，但由于其载量过低，且SP Sepharose Fast Flow耐压性能较差,大大降低了其规模化制备的效率。专利CN200510060559. 4公开了一种胸腺五肽的纯化方法，先采用C18反相制备柱，流动相有甲醇与缓冲液组成，然后用Sephadex G25凝胶介质除盐，其中使用反相制备柱有效成分载量为O. 13mg/mL时99%以上纯度回收率为90. 4% ;有效成分载量为O. 27mg/ mL时，99%以上纯度回收率为70. 5% ;有效成分载量为O. 53mg/mL时，99%以上纯度回收率为 20. 3%。虽然该方法纯化的纯度较高，但是载量非常低，且使用的C18反相层析介质为硅胶基质，其不能耐碱，这不但降低了它的产率，而且还限制了它的应用范围。专利CN200910087566. I公开了一种使用聚酰胺氢键吸附色谱分离纯化胸腺五肽的方法，该方法根据聚酰胺介质对胸腺五肽及其混合物中杂质吸附作用的差异达到纯化目的，最终95%以上的纯度回收率为90%。该方法回收率高，工艺简单，使用的吸附树脂成本低，对设备要求低，易于规模放大。但是该方法上样载量仅为O. 2mg/mL粗品，且最终纯度较低，无法达到商品化要求的纯度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能达到高载量、高纯度和高回收率，而且层析填料可耐高压和高流速的纯化方法。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是单分散聚甲基丙烯酸酯强阳离子交换层析介质在胸腺五肽柱层析纯化中的应用，所述应用方法采用单分散聚甲基丙烯酸酯强阳离子交换层析介质为填料的色谱柱进行柱层析。优选的，用所述单分散聚甲基丙烯酸酯强阳离子交换层析介质作为色谱柱的固定相，将含胸腺五肽的样品上样在该色谱柱上，用盐的水溶液作为流动相洗脱吸附在填料上的胸腺五肽。优选的，所述盐的水溶液是NaCl的醋酸盐缓冲液。优选的，所述单分散聚甲基丙烯酸酯强阳离子交换层析介质是由苏州纳微生物科技有限公司生产，产品型号为NM-MSP。使用NM-MSP强阳离子交换 层析介质纯化胸腺五肽时，只需要以不同浓度NaCl的醋酸盐缓冲液为洗脱液就可将吸附在填料上的杂质和胸腺五肽分别洗脱下来，达到高载量、高纯度及高回收率，同时，强耐反压性还使其能够在高流速下操作。本专利技术的有益效果是单分散聚甲基丙烯酸酯强阳离子交换层析介质NM-MSP不但利于以水溶液做流动相分离纯化胸腺五肽粗品，达到高纯度和高回收率，而且柱层析不会随着盐浓度和流速的变化而发生变化，层析填料可耐高压和高流速、并具备高载量。附图说明图I是实施例I中提纯前的胸腺五肽粗品的HPLC分析图谱。图2是实施例I中提纯后的胸腺五肽的HPLC分析图谱。图3是实施例3和实施例4的压力曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步的描述，但本专利技术并不限于这些实施例。实施例I，以NM-MSP为层析介质做胸腺五肽的纯化采用15X310_ —端可调节的玻璃色谱柱， NM-MSP (苏州纳微生物科技有限公司生产)为层析填料装填层析柱，装柱体积55mL。胸腺五肽粗品为纯度80%，样品经过O. 45um滤膜过滤后上样，有效成分上样载量为15mg/mL。上样后，以3mL/min流速先用IOmM醋酸盐缓冲液(pH 4. 3)冲洗IBV (bed volume，床体积)， 然后用含O. 09mM NaCl的IOmM醋酸盐缓冲液(pH 4. 3)冲洗3BV除杂质，最后用含O. IOmM NaCl的IOmM醋酸盐缓冲液(pH 4. 3)冲洗7BV除杂质并收集被洗脱下的胸腺五肽。收集组分最高纯度99. 7%，纯度在99. 0%以上的收率为72%。图I是实施例I中提纯前的胸腺五肽粗品的HPLC分析图谱，从图中可见数个杂峰，说明粗品中较多杂质。图2是实施例I提纯后的胸腺五肽的HPLC分析图谱，从色谱图中可见杂峰基本消失，说明杂质基本被去除。实施例2，以NM-MSP为层析介质做胸腺五肽的纯化采用50X400mm —端可调节的玻璃色谱柱， NM-MSP (苏州纳微生物科技有限公司生产)为层析填料装填层析柱，装柱体积785mL。胸腺五肽粗品为纯度80%，样品经过O. 45um滤膜过滤后上样，有效成分上样载量为14mg/mL。上样后，以3mL/min流速先用IOmM醋酸盐缓冲液(pH 4. 3)冲洗1BV，然后用含O. 09mM NaCl 的IOmM醋酸盐缓冲液(pH 4. 3)冲洗3BV除杂质，最后用含O. IOmM NaCl的IOmM醋酸盐缓冲液(pH 4. 3)冲洗7BV除杂质并收集被洗脱下的胸腺五肽。收集组分最高纯度99. 8%，纯度在99. 0%以上的收率为67%。实施例3， 测试压力对填料的影响采用10 X 250mm—端可调玻璃柱，NM-MSP (苏州纳微生物科技有限公司)为层析填料，装柱完毕后用3CV(柱体积)超纯水以2mL/min流速平衡色谱柱，柱床体积为14. lmL。测定0-20mL/min (0_1528cm/h)流速范围内的压力，并做压力曲线。实施例4， 测试压力对填料的影响米用10X250mm—端可调玻璃柱，SP Sepharose FF ·(GEHealthcare)为层析填料，装柱完毕后用3CV超纯水以2mL/min流速平衡色谱柱,柱床体积为14.1mL。测定0-20mL/min (0_1528cm/h)流速范围内的压力，并做压力曲线。图3是实施例3和实施例4的压力曲线。从两条压力曲线可见，使用NM-MSP强阳离子交换层析介质为填料的色谱柱具有很强的耐反压性能。本专利技术采用单分散聚甲基丙烯酸酯强阳离子交换层析介质(产品型号NM_MSP，苏州纳微生物科技有限公司生产)为填料的色谱柱进行柱层析，不但利于以水溶液做流动相分离纯化胸腺五肽粗品，达到高纯度和高回收率，而且柱层析不会随着盐浓度和流速的变化而发生变化，层析填料可耐高压和高流速、并具备高载量。以上所述的仅是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
单分散聚甲基丙烯酸酯强阳离子交换层析介质在胸腺五肽纯化中的应用，其特征在于，采用单分散聚甲基丙烯酸酯强阳离子交换层析介质为填料的色谱柱进行柱层析。
【技术特征摘要】
1.单分散聚甲基丙烯酸酯强阳离子交换层析介质在胸腺五肽纯化中的应用，其特征在于，采用单分散聚甲基丙烯酸酯强阳离子交换层析介质为填料的色谱柱进行柱层析。2.如权利要求I所述的单分散聚甲基丙烯酸酯强阳离子交换层析介质在胸腺五肽纯化中的应用，其特征在于，用所述单分散聚甲基丙烯酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：江必旺，陈荣姬，张志红，林生跃，吴俊成，
申请(专利权)人：苏州纳微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。