用于连接锌指模块的组合物制造技术

本文中公开了用于连接DNA结合模块以允许与由1个或多个碱基对分隔的模块子位点特异性和选择性结合的组合物。还描述了制造和使用包含这些接头的组合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开属于基因组和蛋白质工程领域。·背景具有经工程化以与所选择靶位点结合的识别区的锌指蛋白常规上与其他锌指蛋白以及与调节结构域连接并且用来调节基因表达和基因组靶位点。例如，包含与切割结构域有效连接的DNA结合结构域的人工核酸酶已经用于基因组序列的定向改变，包括插入外源序列、使一个或多个内源基因失活、产生具有改变的基因表达模式的生物(例如，动物或作物)和细胞系等。见，例如，美国专利公布No. 20050064474 ；20060063231 ；20070134796 ；20080015164 和国际公布 No. 2007/139982。锌指蛋白模块(例如，一个或多个指状物的工程化锌指)一般使用5个氨基酸的“规范”接头序列如TGEKP (SEQ ID NO: I)或较长柔性接头彼此连接。见，美国专利No. 6，479，626 ;6，903，185 ;7，153，949 和美国专利公布 No. 20030119023。然而，借助这些规范接头连接的锌指蛋白模块仅在靶核酸分子中连接的模块靶子位点之间不存在空位时才最有效地结合。另外，就结合作用而言，设计成允许连接的模块与带有1、2或3个碱基对空位的靶位点结合的前述柔性长接头不在这些不同的碱基对空位之间区分。见，美国专利 No. 6，479，626 ;6，903，185 ;7，153，949 和美国专利公布 No. 20030119023。因此，仍需要用于使锌指模块彼此连接的方法和组合物，从而改善蛋白质跨越1、2或3bp模块间空位的亲和力，以及改善这些蛋白质结合跨越期望长度的空位的靶并且不与没有这种期望长度的空位的其他靶进行非选择性结合的选择性。用于在相邻模块子位点之间区分0、1、2、3个或甚至更多个碱基对空位的锌指模块的接头将允许任何锌指融合蛋白(包括锌指转录因子(ZFP-TF)和锌指核酸酶(ZFN))的更大设计能力。专利技术简述本文中公开了用于使DNA结合模块(例如，锌指模块)此次连接的接头。另外，描述了包含这些接头的融合蛋白，例如锌指蛋白，所述融合蛋白转而与调节结构域(如转录调节结构域)或与核酸酶融合。本公开还提供了使用这些融合蛋白及其组合物用于在细胞中调节基因表达、定向切割目的区域内细胞DNA(例如，内源细胞染色质)和/或在预定目的区域同源重组的方法。因此，在一个方面中，本文中描述了在氨基(N)端指状物的最末残基(一般是羧基(C)端锌配位残基)和C端指状物的第一残基(一般是第一(N端)保守芳族残基)之间包含5个或更多个氨基酸(例如7-17个氨基酸)的接头。在某些实施方案中，接头包含N端残基、C端残基和相对于末端残基为内部的残基，并且进一步地其中所述N端残基或内部残基包含至少一个脯氨酸残基，例如包含氨基酸序列x_-xn-x_的接头，其中X是任何氨基酸残基，Xn包含至少3个氨基酸残基并且XNi^P Xn的至少一者包含脯氨酸残基。在某些实施方案中，接头包含至少两个脯氨酸残基(例如，2、3、4个或更多个)。在其他实施方案中，接头包含至少一个脯氨酸残基和至少一个碱性残基(例如，Arg、His或Lys)。在其他实施方案中，接头包含至少两个碱性残基(例如，Arg、His或Lys)。在某些实施方案中，接头是在表4、5、6、9、10、11或13的任一表中显不的一个接头。在另一个方面，提供了包含如本文所述的接头的融合多肽。在另一个方面，提供了编码如本文所述的任一种接头或融合蛋白的多核苷酸。 在又一个方面，也提供了包含任一种如本文所述的多肽(例如，融合多肽)和/或多核苷酸的细胞。在又一个方面，也提供了包含如本文所述的多肽(例如，融合多肽)和/或多核苷酸的生物(例如，哺乳动物、真菌和植物)。可以在细胞中表达融合蛋白，例如，通过将融合蛋白输送至细胞或通过将编码融合蛋白的多核苷酸输送至细胞来表达。如果这种多核苷酸是DNA，则将它转录并翻译以产生融合蛋白。如果作为RNA分子输送，则将它立即翻译，因此产生融合蛋白。在这份公开的其他地方提出了用于输送多核苷酸和多肽至细胞的方法。根据作为整体的公开内容，这些方面和其他方面将对技术人员是轻易显而易见的。附图简述图I，小图A和小图B,显不不例性锋指蛋白和接头的氣基序列。图IA显不用于这些研究的每种宿主ZFP的氨基酸序列(ZFP 8196的F1-F4在SEQ ID NO: 130 ；SEQ IDNO: 131 ；SEQ ID NO: 132 和 SEQ IDNO: 133 中显示；ZFP 7263 的 Fl 至 F4 在 SEQ ID NO: 134 ；SEQ IDNO: 135 ；SEQ ID NO: 136 和 SEQ ID NO: 137 中显示；ZFP 7264 的 Fl 至 F4 在 SEQ IDNO: 138 ；SEQ ID NO: 139 ；SEQ ID NO: 140 和 SEQ IDNO: 141 中显示)。氨基酸由单字母代码命名。每一个序列以氨基端一羧基端方向列出，因此每种蛋白质的氨基端是指状物I的第一甲硫氨酸，并且羧基端是指状物4的最末丝氨酸。“F1”、“F2”、“F3”和“F4”分别指每种蛋白质的第一、第二、第三和第四指状物。加下划线部分表示指状物交界处常规上视为接头序列的氨基酸残基。将识别螺旋加框表示。图IB显示接头文库设计，其中通过将中央接头中的两个或三个残基的密码子替换为2个至12个充分随机化的密码子的混合物而产生每个文库。文库密码子由(NNS) 2_12代表。图2，小图A至小图D，是描述具有所示锌指蛋白和接头的噬菌体汇集物的空位选择性的图。图2A显示了使用带有Ibp插入碱基的靶(ATAAACTGdCAAAAGGC(SEQ ID NO:33)(表2A))选自ZFP8196文库的噬菌体汇集物，其中测试所述噬菌体汇集物与表2C中每个ZFP8196靶的结合。图2B显示了使用带有Ibp插入碱基的靶(CCACTCTGhTGGAAGTG(SEQ IDNO: 43)(表2A))选自ZFP7263文库的噬菌体汇集物，其中测试所述噬菌体汇集物与表2C中每个ZFP7263靶的结合。图2C显示了使用带有Ibp插入碱基的靶(TTAAAGCGhGCTCCGAA (SEQID NO: 38)(表2A))选自ZFP7264文库的噬菌体汇集物，其中测试所述噬菌体汇集物与表2C中每个ZFP7264靶的结合。图2D显示了使用带有2bp插入碱基的靶(ATAAACTGdbCAAAAGGC(SEQ ID NO:34)(表2A))选自ZFP8196文库的噬菌体汇集物，其中测试所述噬菌体汇集物与表2C中每个ZFP8196靶的结合。每个测试还包括排除与DNA非特异性结合的针对其他两个宿主ZFP的两个对照靶以及不包括靶位点的阴性对照样品。显示了成功结合每种靶的噬菌体的％。每种噬菌体汇集物来自第五轮选择。停留效率基本上如先前描述那样测定(Rebar 等，Methods in Enzymology, 1996 (267) : 129-149)。图3，小图A和小图B，显示针对含有所示空位的靶位点所选择的接头。图3A显示在ZFP8196、ZFP7263和ZFP7264的背景下针对跨越Ibp空位所选择的接头序列(SEQ IDNO: 142至166)。图3B显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·帕斯乔恩，E·J·瑞巴，
申请(专利权)人：桑格摩生物科学股份有限公司，
类型：
国别省市：