本发明专利技术公开了特异性抑制NK细胞受体KIR3DL1的小核酸干扰分子及其应用。特异性抑制NK细胞受体KIR3DL1的小核酸干扰分子，其靶向的KIR3DL1的mRNA的genbank登录号为NM_013289。通过大量实验发现：本发明专利技术siRNA片段可以明显抑制NK细胞膜的KIR3DL1受体的表达，经过各种化学修饰的siRNA具有相同的抑制KIR3DL1表达的效果。抑制KIR3DL1表达以后可以使NK细胞中IFN-γ和TNF-α细胞因子的表达显著升高。同时，转染siRNA后可以显著增强NK细胞的杀伤功能。因此，特异性抑制NK细胞受体KIR3DL1的小核酸干扰分子可以在制备抗艾滋病药物中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及特异性抑制NK细胞受体KIR3DL1的小核酸干扰分 子及其应用。
技术介绍
艾滋病是20世纪80年代开始流行的新发传染性疾病。自1981年在美国发现首例艾滋病病人以来，艾滋病已广泛分布于全球五大洲210多个国家和地区，UNAIDS/WH0《2009年全球艾滋病流行趋势》报告指出，截至2009年底，目前全球有大约3340万艾滋病感染者，其中2009年新增感染者260万人，180万人死干与艾滋病相关的疾病。艾滋病已经成为严重危害人类生命和健康的疾病。从2009年开始，艾滋病是我国法定报告传染病死亡首位的疾病，由于目前艾滋病病毒耐药毒株的不断产生和流行，导致艾滋病抗病毒治疗和抗机会性感染治疗的疾病负担也日益加重。所以，在目前的形势下，探索和研制一些疗效明确并且毒副作用小的艾滋病抗病毒治疗方法和药物就显得尤为重要。在过去的几十年间，人们把研究重点都集中在获得性免疫对HIV-I感染的免疫应答上，但到目前为止还没有免疫治疗和疫苗研究的突破性进展。NK细胞(natural killercell)是ー个独立于T细胞和B细胞的淋巴细胞亚群，NK细胞杀伤病原微生物的作用是天然的，无需抗体存在或预先加以致敏。通常知道，活化的NK细胞可分泌较高水平的IFN-Y、GM-CSF和TNF-α等细胞因子，在抗病毒、抗细菌及抗肿瘤中发挥着极其重要的作用ト3]。近来的研究发现，HIV-I感染的患者外周血中NK细胞的数量和功能发生改变，提示NK细胞在对HIV-I感染的免疫应答以及对HIV-I感染细胞的清除中可能发挥着重要的作用。NK细胞有不同的类型，外周血中大部分NK细胞为⑶3-⑶56+的细胞。NK细胞表面还具有不同的活化/抑制性受体，并在生理和不同病理条件下，其功能发生变化，影响NK细胞对靶细胞的作用发挥。KIR3DL1是NK细胞的抑制性受体，其配体为含有Bw4表型的MHC-I分子。HIV-I感染者体内KIR3DL1的变化与疾病的进程、感染者体内病毒RNA的载量以及NK细胞对HIV-I病毒感染细胞的清除等方面关系极为密切。我们对江苏省10例HIV-I阴性(对照组)、不同传播途径的实验组分别为25例输血感染HIV-I者、8例吸毒感染HIV-I者、20例异性感染HIV-I者、17例同性感染HIV-I者和11例母婴传播的HIV-I儿童感染者NK细胞的数量和NK细胞上KIR3DL1受体也进行了初步研究，结果显示在实验组和对照组比较，NK细胞的数量在实验组中明显下降，并和对照组有显著性的差异；KIR3DL1在实验组NK细胞上的表达明显降低，并和对照组有显著差异。目前小核酸干扰技术(RNAi)是生物科技和创新药物研究中最热门的领域之一，它已经吸引了许多大型制药公司的投资。2006年赢得诺贝尔医学奖的科学成果就是以小核酸干扰技术为基础的。科学界普遍认为，通过利用小核酸干扰技术，有可能产生出前景不错的治疗药物，用于治疗癌症和感染性疾病这类采用通常技术难以提高疗效的疾病。目前国际上已有12个对称性小核酸干扰siRNA药物进入一到三期临床试验，但是绝大部分是外用和4局部给药，只有ニ项是全身静脉给药，其中靶向肿瘤相关基因核糖核苷酸还原酶M2亚基的CALAA-Ol对称小核酸干扰药物和抑制肝癌相关基因的ALN-VSP，已被FDA批准进入肿瘤静脉给药的I期临床试验。经流式细胞仪检测、qRT-PCR法、Westernblot蛋白印迹实验、杀伤功能检测等，这种小核酸干扰分子能显著抑制KIR3DL1基因的表达，并明显提高NK细胞对HIV感染细胞的杀伤作用。与目前艾滋病抗病毒药物比较，小核酸干扰分子是ー种作用机理新颖、高效快速、特异稳定、靶向性好、副作用小新的抗艾滋病药物分子。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供特异性抑制自然杀伤细胞受体KIR3DL1的小核酸干扰分子SiRNA0本专利技术的另ー目的是提供该siRNA的应用。特异性抑制NK细胞受体KIR3DL1的小核酸干扰分子，其靶向的KIR3DL1的mRNA的 genbank 登录号为 NM 013289。本专利技术所述的特异性抑制人NK细胞受体KIR3DL1的小核酸干扰分子siRNA是通过如下方法设计，并经化学合成得到的首先在基因库中寻找靶向基因KIR3DL1的mRNA序列，并从起始密码后75个碱基开始寻找AA+N19+UU序列或AA+N19序列(N19为任意19个mRNA核苷酸序列)，然后计算所选择的19-23nts mRNA碱基序列中G/C比例在30%到70%之间，再将19-23nts mRNA序列用Blast搜寻EST基因库，确认所靶向的基因是唯一的，再设计19-23个反义RNA，且每条链3’端有两个脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂，并合成双链的SiRNA0 本专利技术所述的NK细胞受体KIR3DL1的小核酸干扰分子序列优选自以下K1 K5所 示的SiRNA中的任意一条，或者优选由ΚΓΚ5所示的SiRNA出发，采用胆固醇、硫代、甲基化 正义链或/和反义链进行化学修饰，形成每条链3’端有两个脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂，经过相关修饰，具有19-23nt的能诱发RNA干扰的双链小核酸干扰分子siRNA ;所述的 ΚΓΚ5 所示的siRNA如下 Kl:5’UAUACAAAGAAGACAGAAUdTdT 3’ 3，dTdTAUA腳UUCUUC腳CUUA5，； K2:5，CUACAGAUACCAUCUUGUAdTdT3， 3’ dTdTGAU⑶CUAUG⑶AGAACAU5’ ； K3:5 ’ UGCAAUGUUGGUCAGAUAUdTdT3， 3’ dTdTACGUUACAACCAGUCUAUA5’ ； K4:5，ACAGAACCAAGCUCCAAAUdTdT3， 3’ dTdTU⑶CUUG⑶UCGAG⑶UUA5’ ； K5:5，GCAAGGUCAACAGAACAUUdTdT3， 3’ dTdTC⑶UCCA⑶U⑶CUU⑶AA5’。 所述的NK细胞受体KIR3DL1的小核酸干扰分子序列进ー步优选自所述的K5所示 的siRNA，或者进ー步优选由所述的K5所示的siRNA出发，采用胆固醇、硫代、甲基化正义链 或/和反义链进行化学修饰，形成每条链3’端有两个脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂，经过相关修饰，具有19-23nt的能诱发RNA干扰的双链小核酸干扰分子siRNA。所述的由所述的K5所示的siRNA出发，采用胆固醇、硫代、甲基化正义链或/和反义链进行化学修饰，形成每条链3’端有两个脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂，经过相关修饰，具有19-23nt的能诱发RNA干扰的双链小核酸干扰分子siRNA更进ー步优选自以下K6 K11所示的siRNA中的任意一条Κ6:5’ chol-ACAGAACCAAGCUCCAAAUdTdT 3’3’ dTdTUGUCUUGGUUCGAGGUUUA 5’ ；K7:5’ chol-A-s-C-s-A-s-GAACCAAGCUCCAAA-s-U dTdT 3’3’ dTdTUGUCUUGGUUCGAGGUUUA 5’ ；K8:5，chol-(mA)(mC)(mA)GAACCAAGCUCCAAAUdT-s-dT 3’3’ dT本文档来自技高网...
【技术保护点】
特异性抑制NK细胞受体KIR3DL1的小核酸干扰分子，其特征在于所述的NK细胞受体KIR3DL1的小核酸干扰分子靶向的KIR3DL1的mRNA的genbank登录号为NM_013289。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：羊海涛，傅更锋，还锡萍，徐金水，陈国红，徐晓琴，胡海洋，郭宏雄，邱涛，王小亮，张之，刘晓燕，闫红静，丁萍，丁建平，
申请(专利权)人：江苏省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：
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