卫氏并殖吸虫成虫microRNA及其应用制造技术

本发明专利技术属于寄生虫学领域，提供了一种卫氏并殖吸虫成虫microRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO：1～129所示、或者与SEQIDNO：1～129中的任何一条序列互补的序列。本发明专利技术还提供了上述的卫氏并殖吸虫成虫microRNA在制备抗卫氏并殖吸虫成虫的疫苗中的应用。本发明专利技术还提供了一种抑制卫氏并殖吸虫成虫生长发育的组合物。本发明专利技术还提供了一种基因芯片。本发明专利技术首次从卫氏并殖吸虫成虫分离获得一类新的miRNA，这些miRNA能影响卫氏并殖吸虫成虫的生理功能，同卫氏并殖吸虫的发育，分化相关，本发明专利技术可制备用于抑制卫氏并殖吸虫成虫的基因工程疫苗，为防治卫氏并殖吸虫提供了新的途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及寄生虫学领域，尤其涉及一种卫氏并殖吸虫，具体涉及卫氏并殖吸虫成虫特异表达的micoRNA及其应用。
技术介绍
卫氏并殖吸虫{Paragonimiasis westermani)也称肺吸虫,成虫主要寄生于人、猫、狗等肺脏里，虫卵随排泄物排出体外，进入水中发育并孵出毛蝴。毛蝴侵入第一中间宿主川卷螺，经过胞蝴、母雷蝴、子雷蝴与尾蝴各期，尾蝴从螺体逸出后，侵入第二中间宿主石蟹或蜊蛄。体内发育为囊蝴，人因生食含有石蟹或蜊蛄而感染。童虫在人体需经移行才能到达肺脏。卫氏并殖吸虫病一般症状表现为外周血嗜酸性粒细胞增多，咳嗽、咳铁锈色痰，如果虫体寄生在其他部位也会产生相应症状。目前，该病的诊断主要是痰液涂片检查虫卵 和免疫学检查血清抗体。MicroRNAs CmiRNAs)是一类大小长约2(Γ25个核苷酸，内源性的具有调控功能的非编码RM,在许多真核生物中都曾经被发现。这类RNA的功能主要是参与机体或细胞的调节途径，包括发育、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等过程。在寄生虫研究领域，已有研究表明寄生线虫存在独特的miRNA转录后调控机制，它们可以通过miRNA实现对宿主和自身基因表达模式的精确调控，从而提高感染和自身增殖的几率并逃避免疫监视。通过选择性地抑制或阻断某一特定发育期线虫的发育，从而减少和阻断寄生线虫的传播途径。卫氏并殖吸虫成虫特异表达的miRNA有可能成为其免疫预防和化学防治的新分子靶标，为核酸疫苗的制备奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种卫氏并殖吸虫成虫micoRNA及其应用，所述的这种卫氏并殖吸虫成虫micoRNA及其应用要解决现有技术中的抗蠕虫药物造成的寄生虫抗药性问题，以及动物产品和环境中的药物残留问题，同时提供了一种新的抑制卫氏并殖吸虫生长发育的方法。本专利技术一种卫氏并殖吸虫成虫microRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1 129所示、或者与SEQ ID NO :1 129中的任何一条序列互补的序列。其中，所述互补的序列为DNA或RNA。进一步的，所述互补序列为经过修饰的DNA或RNA，具体的，如硫代修饰或甲氧基修饰。本专利技术还提供了任一所述的卫氏并殖吸虫成虫microRNA在制备抗卫氏并殖吸虫成虫的疫苗中的应用。本专利技术还提供了一种抑制卫氏并殖吸虫成虫生长发育的组合物，含有有效量的至少一个寡核苷酸，所述的寡核苷酸特异性的对应于如SEQ ID NO: I 129中任一所示的microRNA序列或者与SEQ ID NO: I 129中的任何一条序列互补的序列。 本专利技术还提供了一种基因芯片，包括一个固相载体，在所述的固相载体上固定有至少一个寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性的对应于如SEQ ID NO: I 129中任一所示的microRNA序列或者与SEQ ID NO: I 129中的任何一条序列互补的序列。本专利技术所提供的卫氏并殖吸虫成虫特异表达的micoRNA均分别克隆卫氏并殖吸虫成虫，成熟的miRNA序列长度为18 25 nt。对其miRNA进行深度测序，获得卫氏并殖吸虫成虫的miRNA表达谱，通过比对发现，SEQ ID NO :1 129所示的miRNA只在卫氏并殖吸虫成虫中表达，而在参照基因组日本血吸虫中不表达。因此，在卫氏并殖吸虫成虫内过量表达SEQ ID NO :1 129或采用miRNA反向互补序列抑制SEQ ID NO :1 129的表达将影响卫氏并殖吸虫成虫生理功能及器官分化相关的功能。因此，本专利技术卫氏并殖吸虫成虫特异表达的miRNA可用于制备抗卫氏并殖吸虫的疫苗。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果 本专利技术卫氏并殖吸虫成虫特异表达的miRNA可以选择性的抑制或阻断肌肉期这一特定发育期虫体的发育，从而减少或阻断寄生虫，尤其是卫氏并殖吸虫的传播。本专利技术miRNA制备成为卫氏并殖吸虫疫苗时，作为核酸疫苗，避免了传统抗蠕虫药物造成的全球性分布的寄生虫抗药性问题，也不会导致动物产品或环境种内药物的残留。具体实施例方式实施例I 一、miRNA的获得 1.总RNA抽提 1)将样本(卫氏并殖吸虫成虫一条)放入研体中，加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50 - IOOmg组织/ml Trizol加入Trizol,转移入离心管； 2)加入250μ L氯仿，剧烈振荡10s，使液体充分混匀呈乳白状(无分相现象)后，再室温静置5min ； 3)在4°C 条件下，以 12000r/min 离心 15min ； 4)将上层水相转移到一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，然后在4°C条件下静置10- 15min ； 5)在4°C条件下，以12000r/min离心15min,小心并尽可能去掉上清； 6)用ImL75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁，在4°C条件下，以12000r/min离心8min，然后小心弃去乙醇； 7)将RNA沉淀进行干燥(不能完全干燥)处理后，用10μ L RNase - free水将RNA溶解，直接用于反转录。 2.总RN A纯度和完整性检测 I )纯度检测取I UL R N A样品50倍稀释,在BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪上测定OD值，OD 260/0D 280的比值大于I. 8。2)总RNA完整性取RNA样品I μ L，1%琼脂糖凝胶电泳80 VX 20 min，用凝胶成像系统观察总RNA 5S rRNA, 18S rRNA和28S rRNA条带，三条带条带完整。 3.small RNA序列的获得和筛选 用15% PAGE胶回收20-30 nt的small RNA，加上5’和3’端接头(购自Illumina公司)后实施RT-PCR (反转录试剂盒购自Invitrogen公司)。产物经6 %TBE PAGE胶纯化后进行Solexa测序。然后屏蔽掉可能为接头序列的部分、测序质量差的序列(例如测序信号很低等)及长度小于18 nt的序列获得clean reads。 4.miRNA的鉴定用 BLAST 程序(NCBI, www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast)将 clean reads 与 GenBank 和Rfam database (version 9. O) (http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/mirna)进行比对分析，去除非编码RNA序列,包括rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA,和other ncRNA ;通过Repeatmasker (http: //www. repeatmasker. org)去除转座子等重复序列；然后搜索 SangermiRBase (version 13. O)数据库,寻找序列相似性miRNA。将卫氏并殖吸虫所表达的miRNA与已报道的日本血吸虫进行比较，分别屏蔽掉两两共有相关的序列，获得卫氏并殖吸虫未注释的miRNA。此外，为了提高反向互补序列的作用和细胞内稳定性，上述卫氏并殖吸虫特异性 miRNA的反向互补序列可以是DNA或RNA，还可以对反向互补序列进行硫代、甲氧基等修饰。实施例2 本专利技术还提供了任一所述的卫氏并殖吸虫成虫miCToR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卫氏并殖吸虫成虫microRNA，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1～129所示、或者与SEQ？ID？NO：1～129中的任何一条序列互补的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈家旭，周晓农，艾琳，陈木新，朱兴全，陈韶红，张永年，李浩，郭俭，田利光，蔡玉春，卢艳，储言红，陈海宁，张玲玲，周洋，张加，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，
类型：发明
国别省市：