本发明专利技术涉及一种具有防治植物黄萎病功能的内生菌的获得方法及其应用，属于生物技术领域。所述的降解大丽轮枝菌毒素蛋白的植物内生细菌的获得方法，是把从植物体内分离得到的植物内生细菌的菌体与大丽轮枝菌毒素混合培养，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定混合培养后的蛋白条带与原毒素的蛋白条带进行比较，混合培养体系缺少了26KD蛋白条带的为目的菌株。该方法目标明确，机理清楚。解决了生物防治土传病害中的生防微生物受土壤环境影响大，效果不稳定的缺点。本发明专利技术利用大丽轮枝菌的致病特点和植物内生细菌在植物体内传导的特性，直接针对引起植物病害的黄萎病菌毒素筛选降解毒素的内生细菌以达到有效防治植物黄萎病的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，特别涉及植物内生细菌通过降解大丽轮枝菌毒素的方法来有效防治植物黄萎病的危害。
技术介绍
大丽轮枝菌可引起植物黄萎病，该病是一种危害性极大的维管束系统病害，该病特征感病植物叶片变黄，久旱遇雨，叶片骤然萎蔫，故称“黄萎病”。大丽轮枝菌寄主范围广泛，其寄主植物多达660种。其中农作物184种，观赏植物323种，杂草153种。在农作物中对棉花、马铃薯、茄子、番茄、辣椒等都具有侵染性，且能够相互转染。而禾木科作物比如水稻、麦类、玉米等以及某些杂草则侵害很少。近年来，黄萎病在我国主产农作物区相继造成严重危害，黄萎病已成为严重影响我国农作物高产稳产的主要障碍，尤以落叶型黄萎病为严重。大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)归属于淡色菌科丛梗孢轮枝菌属，具有独特的形态学特征。通过显微镜观察，该菌分生孢子梗细，数量少且透明，分生孢子较小，一般为3-6X1. 5-2. Oym,富含黑色微菌核。大丽轮枝菌以微菌核和孢子形态存在土壤中，条件适宜微菌核和孢子萌发产生侵染器官，从植物根部侵入进入植物体内，部分菌体形成单细胞形态在植物根茎叶的筛管中传导和增殖，并分泌毒素，刺激植物细胞增生，堵塞筛管，引起植物萎蔫。大丽轮枝菌属土传性非专性寄生菌，在温度25_28°C，相对湿度在80%以上，此病容易发生流行。棉花定植后I个月左右开始，地上部位出现病症，一直到收获结束时持续发病。最初，下部叶片局部萎蔫，叶边上卷。之后，病部由黄白色转为黄色，叶片边缘变色较多，以小叶脉为中心呈楔形。接下来，变色部位逐渐扩大，整片小叶变黄，慢慢褐变枯死。病害加重时,上部叶片也依次发病枯死,并导致下部叶片慢性枯萎,剖检病株叶柄和整,可见导管部有黄褐变。生物防治被认为是最具有发展潜力的重要防治方法，而获得高效拮抗菌是生物防治的基础。吴献忠(植物病理学报，1996,26(3) :281-282)采用等电点聚焦技术分析棉花黄萎病菌纤维素酶同工酶，分析表明电泳谱带为8条的均为落叶型菌系。将我国棉花黄萎病菌划分为3个生理型，即落叶型黄萎菌株致病力最强，占15. 7% ;叶枯型菌株为中等致病力，占54. 2%;黄斑型菌株属弱致病力，占30.1%。王慧萍等(南京师范大学报，2005, 28(2) :83-85)筛选了一株抗茄子黄萎病的芽孢杆菌F53，改良后的该菌株发酵条件对黄萎病菌具有很好的抑菌活性。雷白时(安徽农业科学，2009, 37(2) :672-674)从各地的土样中分离到84株拮抗细菌菌株，复筛得到强抑菌活性的拮抗细菌7-30菌株。李术娜(中国农学通报，2009, 25(15) :26-30)考察了拮抗细菌2_70在棉花体内的定殖试验，结果表明该菌不仅能在灭菌土和非灭菌土中定殖，而且五个月后仍能保持较高的抑菌活性。关于黄萎病菌的致病机制，病原菌在植株体内产生毒素作用的结果。在病原菌侵染寄主，即由粘附接触一入侵一繁殖扩展一显症，在这个病理学过程中，病原菌毒素所扮演的主导作用受到越来越多的研究支持。章元寿(真菌学报，1991，10(3) :169-181)等越来越多的研究表明，大丽轮枝菌分泌的毒素是导致黄萎病的关键因素，其致萎作用可能是能够凝固植物细胞原生质体，破坏原生质膜的半透性，扰乱棉株的水分平衡，导致植株体内脱落酸含量增加，使棉株体内膨压改变，从而引起萎蔫症状。在液体培养基中，黄萎病菌分泌毒素，这种毒素可诱发与黄萎病菌类似的致病症状Pegg et al(Nature, 1965，208:1228-1229)。经研究表明，大丽轮枝菌产生的毒素是一种糖蛋白复合体(protein-1 ipopoly-saccharide complex, PLPC),其中的蛋白质成分是致萎的活性部分。Nachmias (Physiol. Plant Pathology, 1985，26:43-55)在感病的马铃薯中用PLPC的抗血清检测到了致病抗原毒蛋白的存在，而健康的马铃薯中未能检出。这充分证明PLPC具有内源致病作用，直接参与了病原菌的致病过程。Chu et al (The PlantJournal, 1999，9(41) :972-976)报道得到一个26kDa的糖蛋白，它能诱导产生植保素并能使植物萎蔫。由于研究者的研究方法和手段不同，分离到的许多种毒素蛋白。章元寿等(植物病理学报，1991，21 (I) :49-52)通过纤维素柱层析和琼脂糖凝胶层析，得到一个具有致萎活性的峰蛋白，并发现致病力强的菌株毒素所含的蛋白质和多糖的量高于致病力弱 的菌株毒素。吕金殿等(中国农业科学，1995，28(2) :58-65)用亲和层析法分离纯化毒蛋白，分析显示，它是一种糖蛋白，其蛋白质和糖的含量分别是8. 53%和14.7%。。陈旭升等(江苏农业学报，2000, 16:10-14)对3个典型黄萎病菌分泌毒蛋白进行层析分离，皆得到两个致萎蛋白峰，分子量平均值的范围分别在20kDa和96kDa。傅正擎等(江苏农业学报，1999，15(4) :211 215)将从棉株体内分离获得的内生菌Ala、73a接入棉花黄萎病菌菌株JClB (落叶型)、BP2(非落叶型)的Czapek培养液中，培养不同时间后提取粗毒素，结果表明对BP2产毒素抑制最强的为Ala菌体，抑制率达51. 97%;对JClB产毒素能力抑制最强的是73a菌体，抑制率为72. 60% ;液体培养的黄萎病菌加入内生菌或代谢物后，其黄萎病菌毒素粗提液对棉苗致萎度下降。查阅国内和国外发表的文章，仅查到关于大丽轮枝菌毒素的研究，未查到对毒素降解的研究报道；对于植物内生细菌与大丽轮枝菌的研究，仅查到内生细菌加入离体培养的大丽轮枝菌中能够抑制毒素蛋白的产生，未查到内生细菌与毒素蛋白共同作用，把毒素蛋白降解或者转化成其他蛋白的研究报道。关于应用微生物的功能防治植物黄萎病的公开专利资料201210021045. 8公开了一株棉花内生真菌在棉花黄萎病防治中的应用；201210099459. 2公开了大丽轮枝菌弱毒株的应用；这两个专利是关于真菌的应用。200810183075. 2和20081083072. 9公开了地衣芽孢杆菌的应用；200810183071.4是枯草芽孢杆菌的应用；200910192921. I是铜绿芽孢杆菌的应用；201110197653.x是固氮菌的应用；这五个专利的细菌分离自植物根际，即根际细菌的应用。有关植物内生细菌的专利仅查到200510020328. O中的内生细菌诱导马铃薯抗病；201110082094. 8中的内生细菌防治松树枯梢病；201210049875. I中的内生细菌防治水稻稻瘟病；201110377736. 7分离的内生细菌作为土壤修复剂；201110352670. 6的内生细菌生产防治小麦纹枯病的农药。公开的资料中未查询通过离体筛选降解毒蛋白的植物内生细菌的方法和应用植物内生细菌在植物体内通过降解黄萎病菌毒素的方法来防治黄萎病的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种降解大丽轮枝菌毒素蛋白的植物内生细菌的获得方法和在防治植物黄萎病上的应用。本专利技术的研究人员通过对大丽轮枝菌毒素蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳测定证明大丽轮枝菌的发酵液经100°c水浴lh，6层滤纸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种降解大丽轮枝菌毒素蛋白的植物内生细菌的获得方法，是把从植物体内分离得到的植物内生细菌的菌体与大丽轮枝菌毒素混合培养，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定混合培养后的蛋白条带与原毒素的蛋白条带进行比较，混合培养体系缺少了26KD蛋白条带的为目的菌株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：闫淑珍，陈双林，许芳，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：
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