一种使醋杆菌种富集钙的驯化培养方法技术

本发明专利技术提供了一种使醋杆菌种富集钙的驯化培养方法，该方法采用常用的巴氏醋杆菌，通过改变培养基配比和培养方法，使得现有的巴氏醋杆菌可以实现钙的富集，进而获得高钙含量的菌体和菌液，该菌体和菌液可以用于多种饲料添加剂中，应用到禽畜饲养中时可以大大提高畜禽体内的钙含量，促进畜禽的生长，改善禽畜肉类产品的品质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物制品
，具体涉及。
技术介绍
钙是人体的生命之源，是人体骨骼的主要成份，是人体不可缺少的微量元素，人生各个阶段都必须注重钙的摄入和吸收。人体一旦缺钙，便会导致牙龈出血，皮下出血点，骨质疏松等现象，而且钙离子对人体内分泌腺激素的分泌有决定性的作用，对呼吸、消化、泌尿、神经、内分泌、生殖等系统器官的功能至关重要，钙既是身体的构造者，又是身体的调解者。人类通过食物来摄取身体所需的钙元素，通常成年人每天摄入的钙约为450-500毫克，然而人体代谢过程中每天大约要排出700-800毫克的钙，为维持身体的收支平衡，补钙已引起全民重视。如何提高饮食中的钙含量已经成为不可忽视的问题，现有的补钙产品众多，其中无机钙价格低廉，但是其吸收效率底下，难以与常规食品配合食用；其他采用有机钙的补钙产品虽然吸收效果较好，但是由于其制备方法较为苛刻，使其成本较高，难以广泛的推广应用，无法满足普通民众对于钙源的需求；一般的发酵菌种中含钙量较低，直接应用于食品加工和饲料加工时所能提供的有机钙源少，无法满足生产的要求，同时越来越多的科研表明通过驯化等手段可以改变菌种的某些特性，但是如何将驯化这一培养方式应用于富集钙的生产实践中一直是难以突破的技术难题。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的不足之处，提供了，该方法采用常用的巴氏醋杆菌，通过改变培养基配比和培养方法，使得现有的巴氏醋杆菌可以实现钙的富集，进而获得高钙含量的菌体和菌液，该菌体和菌液可以用于多种饲料添加剂中，应用到禽畜饲养中时可以大大提高畜禽体内的钙含量，促进畜禽的生长，改善禽畜肉类产品的品质。本专利技术的具体技术方案是具体步骤如下( I)驯化初级菌液的制备取500ml三角瓶，每瓶装驯化培养液150ml ;灭菌后在30± 1°C和无菌条件下，向每个三角瓶中接入醋杆菌O. lg，将三角瓶密封，放入回旋式摇床中培养，转速90 — IlOrpm，温度30土 1°C，培养45小时结束即可获得驯化初级菌液；其中所述的驯化培养液为牛肉膏4g，碳酸钙30g，磷酸二氢钙25g，玉米粉10g，无水氯化钙O. 3g，磷酸二氢钾O. 25g,玉米衆干粉5g,葡萄糖15g,加水IOOOml后混合均勻既得；所述的醋杆菌选自中科院微生物研究所提供的巴氏醋杆菌，编号为ACCC10600或 Accc 10112 ；(2) 一级种子液的制备取250ml三角瓶，每瓶装培养液100ml，灭菌后在30°C ± I°C和无菌条件下，每个三角瓶接入步骤(I)中获得的驯化初级菌液10ml，将三角瓶密封，放入回旋式摇床中培养，转速每分钟120-130转，温度30°C -32°C，培养25-30小时既得一级种子液；其中所述的培养液中各组分的重量百分比为酪蛋白胨5%，牛肉膏5%，碳酸钙3%，磷酸氢钙2%，玉米粉2%，磷酸二氢钾0.3%，玉米浆干粉0.4%，葡萄糖2. 3 %，水80 % ;(3)种子罐培养菌种液的获得将种子罐培养液加入到已经灭菌的种子罐中，然后通入蒸气加热，利用夹层蒸气加热到90°C _95°C时改用直接蒸气加热，当种子罐中蒸气压力达到O. 11-0. 12兆帕时，保温25-30分钟即可达到灭菌效果；然后关闭蒸气，待种子罐降温至28°C -30°C之间时，将步骤(2)中获得的一级种子液按照种子罐培养液重量1%的用量加入到种子罐中，然后盖好接种帽，开始无菌空气通风发酵，无菌空气用量为每100公斤培养液每分钟用无菌空气O. 05-0. I立方，pH值自然，转速每分钟120-130转，发酵时间为25-30小时，检测OD值应达到O. I毫升，0D600mm = I即可停止发酵，获得种子罐培养菌种液； 其中所述的种子罐培养液中各组分的重量百分比为酪蛋白胨3%，牛肉膏3. 5 %，葡萄糖0.5%，酵母膏3 %，碳酸钙2 %，磷酸氢钙I %，玉米粉I %，磷酸二氢钾0.2%，玉米浆干粉 O. 2%,7jC 85. 6% ；(4)发酵罐培养将发酵罐培养液加入到已经灭菌的发酵罐中，通入蒸气加热，当发酵罐中蒸气压力达到O. 11-0. 12兆帕时，温度121。。-122°c时，保温30-35分钟即可达到灭菌效果；然后向夹层通入自来水降温，当罐中温度降到30°C -31°C时，无菌条件下接入发酵罐培养液重量3%的步骤(3)中获得的种子罐培养菌种液，接种时首先提高种子罐的罐压力，达到O. I兆帕，发酵罐罐压维持在O. 05兆帕，打开接种管道的阀门将种子罐的菌种液直接输送到发酵罐中去，输送到上述定量的菌液后关闭接种管道阀门开始发酵；发酵温度30°C -31°C，转速每分钟150转，通风量每100公斤发酵液每分钟通入无菌空气O. I立方米，pH自然，发酵时间25-30小时，检测OD值应达到O. I毫升，0D600mm = I为合格，既得目标产物；其中所述的发酵罐培养液中各组分的重量百分比为酪蛋白胨4%，牛肉膏3%，酵母膏2.5%，葡萄糖3 %，碳酸钙5 %，磷酸氢钙3.5%，玉米粉3 %，磷酸二氢钾O. 3 %，玉米浆干粉0.7%，乳酸钠2 %，水73 %。其中，本专利技术采用了现有的常规菌种进行驯化，主要选用了从中科院微生物研究所的巴氏醋杆菌，编号为Accc 10600或Accc 10112，经过试验发现本专利技术所提供的驯化培养方法对于上述两个菌株都有着极好的富集钙的作用。而所采用的各级培养液中，专利技术人均进行了适应性的改变，其中驯化培养液是在常规的培养基基础上进行了调整，添加了碳酸钙、磷酸二氢钙、和无水氯化钙三种无机钙源，通过加入这些物质，为菌种培养过程中提供了充足的钙源，且上述无机钙在加入到培养液中时基本上不会提高整个培养液的PH值，因此可以保证上述配比的培养液溶解后整体的pH值维持在6 - 7之间，为菌种的发酵提供了基础的条件和丰富的钙源及营养物质，使得整个发酵过程可以平稳的进行，在现有发酵技术的基础上进一步缩减了发酵所需的时间，提高了生产的效率。经过上述发酵后的醋杆菌，在菌体和菌液中均含有大量的有机钙，同时进过驯化后的上述醋杆菌可以更加适应后续的发酵条件，为后部的进一步发酵提供了充足的钙源及合适的菌体。之后采用的一级种子液培养液和种子罐培养液中，专利技术人均添加了不同比例的碳酸钙和磷酸氢钙，之所以采用上述的物质，除了考虑到无机钙源的成本之外，还主要考虑到这两者水溶后都不会造成整个发酵体系PH的波动，可以维持在弱酸性条件下，这样更加有利于菌种的发酵，在发酵过程中将更多的无机钙转化为有机钙，并将其储存在菌体和菌液中为最终的发酵积蓄钙源。最终的发酵罐培养液中专利技术人将碳酸钙用量提高到5%，磷酸氢钙用量提高到3.5%，均远高于一级种子液培养液和种子罐培养液中的用量，主要就是由于该步发酵为最终发酵过程，经过上述步骤(2)和(3)的发酵过程后，整个醋杆菌已经适应了两种无机钙源存在的培养液，因此提高二者用量不会对菌种的发酵产生抑制作用，同时为发酵提供了更多的无机钙源，有利于有机钙的转化，经过上述发酵过程后，发酵培养液中的无机钙源被充分的利用，其中最终获得的菌体和菌液中经过分析含有多种有机钙，其中醋酸钙含量约为12wt %，钙调蛋白质约为3wt %，葡萄糖酸钙含量约4wt %，较之现有常规发酵培养方法获得的菌体和菌液中，有机钙含量得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使醋杆菌种富集钙的驯化培养方法，其特征在于：具体步骤如下：（1）驯化初级菌液的制备取500ml三角瓶，每瓶装驯化培养液150ml；灭菌后在30±1℃和无菌条件下，向每个三角瓶中接入醋杆菌0.1g，将三角瓶密封，放入回旋式摇床中培养，转速90－110rpm，温度30±1℃，培养45小时结束即可获得驯化初级菌液；其中所述的驯化培养液为：牛肉膏4g，碳酸钙30g，磷酸二氢钙25g，玉米粉10g，无水氯化钙0.3g，磷酸二氢钾0.25g，玉米浆干粉5g，葡萄糖15g，加水1000ml后混合均匀既得；所述的醋杆菌选自中科院微生物研究所提供的巴氏醋杆菌，编号为：Accc10600或Accc？10112；（2）一级种子液的制备：取250ml三角瓶，每瓶装培养液100ml，灭菌后在30℃±1℃和无菌条件下，每个三角瓶接入步骤（1）中获得的驯化初级菌液10ml，将三角瓶密封，放入回旋式摇床中培养，转速每分钟120？130转，温度30℃？32℃，培养25？30小时既得一级种子液；其中所述的培养液中各组分的重量百分比为：酪蛋白胨5％，牛肉膏5％，碳酸钙3％，磷酸氢钙2％，玉米粉2％，磷酸二氢钾0.3％，玉米浆干粉0.4％，葡萄糖2.3％，水80％；（3）种子罐培养菌种液的获得：将种子罐培养液加入到已经灭菌的种子罐中，然后通入蒸气加热，利用夹层蒸气加热到90℃？95℃时改用直接蒸气加热，当种子罐中蒸气压力达到0.11？0.12兆帕时，保温25？30分钟即可达到灭菌效果；然后关闭蒸气，待种子罐降温至28℃？30℃之间时，将步骤（2）中获得的一级种子液按照种子罐培养液重量1%的用量加入到种子罐中，然后盖好接种帽，开始无菌空气通风发酵，无菌空气用量为每100公斤培养液每分钟用无菌空气0.05？0.1立方，PH值自然，转速每分钟120？130转，发酵时间为25？30小时，检测OD值应达到0.1毫升，OD600mm＝1即可停止发酵，获得种子罐培养菌种液；其中所述的种子罐培养液中各组分的重量百分比为：酪蛋白胨3％，牛肉膏3.5％，葡萄糖0.5％，酵母膏3％，碳酸钙2％，磷酸氢钙1％，玉米粉1％，磷酸二氢钾0.2％，玉米浆干粉0.2％，水85.6%；（4）发酵罐培养：将发酵罐培养液加入到已经灭菌的发酵罐中，通入蒸气加热，当发酵罐中蒸气压力达到0.11？0.12兆帕时，温度121℃？122℃时，保温30？35分钟即可达到灭菌效果；然后向夹层通入自来水降温，当罐中温度降到30℃？31℃时，无菌条件下接入发酵罐培养液重量3%的步骤（3）中获得的种子罐培养菌种液，接种时首先提高种子罐的罐压力，达到0.1兆帕，发酵罐罐压维持在0.05兆帕，打开接种管道的阀门将种子罐的菌种液直接输送到发酵罐中去，输送到上述定量的菌液后关闭接种管道阀门开始发酵；发酵温度30℃？31℃，转速每分钟150转，通风量每100公斤发酵液每分钟通入无菌空气0.1立方米，ph自然，发酵时间 25？30小时，检测OD值应达到0.1毫升，OD600mm＝1为合格，既得目标发酵菌液；其中所述的发酵罐培养液中各组分的重量百分比为：酪蛋白胨4％，牛肉膏3％，酵母膏2.5％，葡萄糖3％，碳酸钙5％，磷酸氢钙3.5％，玉米粉3％，磷酸二氢钾0.3％，玉米浆干粉0.7％，乳酸钠2％，水73％。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张起凡，曹崇仁，
申请(专利权)人：济南环亿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：