一种诱导细菌进入活的非可培养状态的方法技术

本发明专利技术公开了一种诱导细菌进入活的非可培养状态的方法。本发明专利技术提供的方法，包括如下步骤：将目的细菌经高压二氧化碳处理，使其进入活的非可培养状态。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术开发一种诱导细菌进入活的非可培养状态的方法，利用高压二氧化碳技术处理细菌，可促使细菌在1h之内快速进入活的非可培养状态；本发明专利技术的方法加快了活的非可培养状态细菌的制备，提高了有关活的非可培养状态细菌的研究进度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及。
技术介绍
在不利环境下，多种细菌会进入一种活的非可培养(viable butnonculturable，VBNC)状态。该状态是非芽孢细菌的一种休眠形式，可以提高细菌在不利环境下的存活能力。目前已知60多种细菌都能进入活的非可培养状态，其中绝大部分为致病菌。虽然活的非可培养状态细菌仍然具有代谢活性，但在该菌常用的非选择性培养基上不能生长或形成菌落，因此常规细菌检测方法如平板计数法检测不到活的非可培养状态细菌的存在，这样就可能低估检测样品中细菌的数量，给人们带来安全隐患。开展有关活的非可培养状态细菌的特征及形成机制等方面的研究对有效杀灭活的非可培养状态细菌至关重要。但由于获得活的非可培养状态细菌需要很长的时间，因此限制了对其研究的进度。目前诱导细菌进入活的非可培养状态的方法主要是寡营养结合低温的方法。但该方法所需的诱导时间长，通常要一个月以上，从而限制了对活的非可培养状态细菌的研究进度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术提供的诱导目的细菌进入活的非可培养状态的方法，包括如下步骤将目的细菌经高压二氧化碳处理，使其进入活的非可培养状态。上述方法中，所述高压二氧化碳处理的条件如下压力为5_7MPa、温度为25-37°C、时间为 5-60min。上述方法中，所述高压二氧化碳处理的条件如下压力为5MPa、温度为25°C、时间为40min ；或压力为5MPa、温度为31°C、时间为30min ；或压力为5MPa、温度为37°C、时间为25min。 在本专利技术的实施例中，所述高压二氧化碳处理为将目的细菌用高压二氧化碳装置进行高压二氧化碳处理，在本专利技术的实施例中，高压二氧化碳装置型号CAU-HPCD-I (高密度二氧化碳杀菌装置，在专利ZL200520132590. X中公开)，具体步骤将20mL待诱导菌液(细菌悬浮液)装入玻璃瓶中，用封口膜封好；将菌液放入反应釜中，对菌液进行HP⑶处理，处理压力为5MPa，处理温度为25°C，保压时间为40min ;达到上述处理参数后立即卸压；得到诱导后菌液。上述方法中，在所述高压二氧化碳处理前还包括如下步骤将所述目的细菌洗涤、悬浮，得到细菌悬浮液。上述方法中，所述洗涤和所述悬浮均采用生理盐水，所述生理盐水具体为O. 85%(质量百分含量)NaCl水溶液。上述方法中，所述目的细菌为处于对数期的目的细菌。上述方法中，所述目的细菌为大肠杆菌，所述大肠杆菌具体为Escherichia coli0157:H7。在上述方法中，在高压二氧化碳处理后，还包括如下步骤检测经过诱导处理后的目的细菌的活菌数和可培养菌数；若可培养菌数为零而活菌数不为零，则目的细菌进入了活的非可培养状态；其中，检测经过诱导处理后的目的细菌活菌数采用PI/SYT09双染法，检测经过诱导处理后的目的细菌可培养菌数采用平板计数法。本专利技术的另一个目的是提供一种细菌培养方法。本专利技术提供的细菌培养方法，包括上述方法的步骤。 本专利技术的实验证明，本专利技术开发，利用高压二氧化碳技术处理细菌，可促使细菌在Ih之内快速进入活的非可培养状态；本专利技术的方法加快了活的非可培养状态细菌的制备，提高了有关活的非可培养状态细菌的研究进度。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，以上实施例仅用以说明本专利技术的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施对本专利技术进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本专利技术的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本专利技术的权利要求范围当中。实施例I、诱导细菌进入活的非可培养状态一、高压二氧化碳诱导I、细菌悬浮液制备采用O. 85% (质量百分含量)NaCl水溶液洗涤对数生长期的E. coli 0157:H7 (菌株编号NCTC12900)菌体两次，然后用O. 85% (质量百分含量)NaCl水溶液重悬菌体，使菌体浓度约为108cfu/mL，作为待诱导菌液(细菌悬浮液)；2、高压二氧化碳处理实验组用自行设计的高压二氧化碳杀菌机(型号CAU-HP⑶-1，高密度二氧化碳杀菌装置，在专利ZL200520132590. X中公开)对菌液进行高压二氧化碳处理；具体步骤将20mL待诱导菌液(细菌悬浮液)装入玻璃瓶中，用封口膜封好；将菌液放入反应釜中，对菌液进行HP⑶处理，处理压力为5MPa，处理温度为25°C，保压时间为40min ;达到上述处理参数后立即卸压；得到诱导后菌液。对照组待诱导菌液不进行高压二氧化碳处理，只在25°C放置40min。二、检测活菌数测定方法采用PI/SYT0 9双染法；具体步骤将配比好的染料混合物(PI SYTO 9体积比为I: I)与诱导后菌液按照3:1000的比例混合，混合均匀后在室温下避光孵育15min ;孵育完成后，在荧光显微镜下观察(1000X)并计数，通常需要选择10个视野，而且一个样品要做两次重复。可培养菌数测定方法采用平板计数法；具体步骤参照GB 4789. 2-2010方法，将诱导后菌液用O. 85%NaCl进行10倍逐级稀释，根据预实验吸取3个连续稀释度的稀释样ImL于灭菌平皿中，倒入约20mL TSA培养基摇匀，待培养基凝固后倒置于37°C培养箱中培养24h，然后记录菌落数。采用上述方法分别检测实验组和对照组的活菌数和可培养菌数，从而计算活的非可培养状态菌数(活菌数-可培养菌数)。以检测细菌是否进入了活的非可培养状态，当可培养菌数为零而活菌数不为零时就认为细菌进入了活的非可培养状态。结果如下实验组诱导后菌液的活菌数为106 79cfu/mL ;诱导后菌液的可培养菌数为O ;进入了活的非可培养状态的菌数为106 79cfu/mL。 对照组的可培养菌数仍约为108cfu/mL，基本认为没有活的非可培养状态的菌。因此，可以看出，本专利技术的方法在高压二氧化碳诱导40min时获得了活的非可培养状态的E. coli 0157:H7。而目前采用的寡营养结合低温法需要I个月的时间，因此本专利技术的方法可以诱导细菌快速进入活的非可培养状态。实施例2、诱导细菌进入活的非可培养状态一、高压二氧化碳诱导I、细菌悬浮液制备与实施例I中的一的步骤I的方法相同。2、高压二氧化碳诱导与实施例I中的一的步骤2的方法基本相同，仅将处理温度变为31 °C，保压时间变为30min ;得到诱导后菌液。二、检测与实施例I中的二的方法相同。结果如下实验组诱导后菌液的活菌数为106 89cfU/mL ;诱导后菌液的可培养菌数为O ;因此进入了活的非可培养状态的菌数为106 89cfu/mL。对照组的可培养菌数仍约为108cfu/mL，基本认为没有活的非可培养状态的菌。因此，可以看出，本专利技术的方法在高压二氧化碳诱导30min时获得了活的非可培养状态的 E. coli 0157:H7。本实施例同实施例I相比，高压二氧化碳使E. coli 0157:H7进入活的非可培养状态的诱导时间更加缩短，而且获得的活的非可培养状态的菌数与实施例I接近。实施例3、诱导细菌快速进入活的非可培养状态一、高压二氧化碳诱导I、细菌悬浮液制备与实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导目的细菌进入活的非可培养状态的方法，包括如下步骤：将目的细菌经高压二氧化碳处理，使其进入活的非可培养状态。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：廖小军，赵凤，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：