一种耐酸性反硝化菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种耐酸性反硝化菌，其分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)G16X‑D，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年10月13日，保藏编号为CGMCC NO.13108。本发明专利技术还公开了上述耐酸性反硝化菌在酸性水体中的应用。该菌株能够适应酸性环境，达到在酸性条件下硝酸盐氮的高效脱除，并且亚硝酸盐氮很少累积，无二次污染，具有很大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种耐酸性反硝化菌及其应用
本专利技术涉及微生物
，尤其涉及一种反硝化菌，具体为一种耐酸性反硝化菌及其应用。
技术介绍
原地浸出采铀技术已成为我国乃至世界疏松砂岩型铀矿床开采的主流。其中，酸法地浸采铀过程中，多使用硫酸为溶浸试剂，对地下水的生态环境有严重影响，主要表现在两个方面:一是将含矿层中的元素大量溶浸出来进入含矿层的地下水溶液中，造成了地下水含矿含水层放射性核素(铀、镭等)、酸以及其他重金属的污染；二是由于向含矿层中注入了溶浸试剂(硫酸)和淋洗剂(硝酸铵)，使含矿层地下水中的试剂组分(NO3-、SO42-)大大超标。微生物脱氮即反硝化作用是在厌氧或缺氧的条件下，以硝酸盐作为电子受体，将硝酸盐或亚硝酸盐逐步还原为气态氮的过程。但反硝化菌适宜生长的pH条件一般为中性或弱碱性，严重限制了其使用范围。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可在低pH环境中生长的硝酸盐还原菌，即耐酸性反硝化菌。本专利技术的另一目的是耐酸性反硝化菌在酸性水体中的应用，如应用于矿山地下水、生产废水及其他类似酸性水体的脱氮。为实现上述目的，以新疆某砂岩型铀矿地下水为样品，于反硝化培养基中富集分离并纯化获得了一株耐酸性反硝化菌。所获得的耐酸性反硝化菌株经鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)G16X-D。革兰氏阴性，菌体呈短杆状，菌落表面湿润，半透明。所述的反硝化培养基组成为：NaNO31g·L-1；K2PO4·3H2O0.654g·L-1；MgSO4·7H2O0.1g·L-1；FeSO4·7H2O0.01g·L-1；YeastExtract0.5g·L-1；Glucoseg·L-1。固体培养基中另加1.5-1.8％的琼脂。培养基于121℃、0.1MPa高温高压灭菌，其中，FeSO4·7H2O使用0.22um微孔滤膜过滤灭菌。上述耐酸性反硝化菌通过ELx808BLG型Biolog微生物自动鉴定系统培养24h，其结果SIM＝0.75，大于0.5，DIST＝3.162，小于5，PROB＝0.962，结果可靠，说明本专利技术菌株属于铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。上述耐酸性反硝化菌，其16SrDNA上有效长度约为1437bp的核苷酸序列，16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。将该序列输入GenBank，用Blast软件与数据库序列进行比对分析，结果表明与Pseudomonasaeruginosa的16SrDNA序列的相似性达到99％。基于16SrDNA的系统发育分析结果以及生理生化特性，鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的一种新菌株。本专利技术的耐酸性反硝化菌的适宜脱氮pH在4.5以上，最优脱氮pH为5.77～7.71。在初始硝酸盐浓度为160mg/L，以1％为接种量，pH为5.77～7.71情况下，本专利技术的反硝化菌32h可以将硝酸盐氮完全脱除。本专利技术的耐酸性反硝化菌脱氮时，葡萄糖的COD值与硝酸盐N的浓度比为2.5～5，优选为3～4，最优选为3。在初始硝酸盐浓度为160mg/L，以1％为接种量，pH为4.5情况下，当C(葡萄糖)/N＝3时，硝酸盐去除率达到90％，且无亚氮积累。本专利技术的耐酸性反硝化菌的脱氮温度为20℃～40℃，优选适宜的脱氮温度为35℃～40℃。在初始硝酸盐浓度为160mg/L，以1％为接种量，温度为35℃～40℃情况下，本专利技术的反硝化菌72h能将硝酸盐氮去除80％～90％。本专利技术的耐酸性反硝化菌对高浓度NO3——N仍具有较强的反硝化能力，对初始硝酸盐的浓度没有特殊的限制。本专利技术实施例中，在初始硝酸盐浓度为420mg·L-1时，本专利技术的耐酸性反硝化菌仍具有反硝化能力。进一步优选初始硝酸盐浓度为50～280mg·L-1，更优选为70～200mg·L-1。本专利技术的耐酸性反硝化菌在pH值为4.5条件下可以以硝酸盐为电子受体进行反硝化反应，在初始硝酸盐浓度为160mg·L-1的缺氧条件下，1％为接种量，35℃时，耐酸性反硝化菌PseudomonasaeruginosaG16X-D可以在72h内降解90％的硝酸盐氮，达到酸性条件下硝酸盐氮的高效脱除，并且亚硝酸盐氮很少累积，无二次污染。本专利技术采用自新疆某砂岩型铀矿地下水中分离筛选得到的耐酸性反硝化菌，该菌株能够适应较酸性的环境，达到在酸性条件下硝酸盐氮的高效脱除，并且亚硝酸盐氮很少累积，无二次污染。经扩大培养后，可以直接应用在酸性矿山地下水、生产废水及其他类似酸性水体中进行脱氮，在实际工程中具有很大的应用价值。本申请的耐酸性反硝化菌将针对酸法地浸矿山退役后，采区含矿含水层水体pH低、硝酸盐含量高以及富含多种重金属等特点，在酸性或弱酸性环境条件下实现硝酸盐氮的去除，进而逐步提高水体pH值，使重金属逐步沉淀，实现该类水体的生物修复，不仅对以后该类水体污染以及类似环境问题的生态修复有着重要的应用前景，更具有重要的社会和环境意义。生物保藏说明本专利技术的耐酸反硝化菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，于2016年10月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.13108，其简称为G16X-d。附图说明下面结合附图对本专利技术做进一步说明。图1为本专利技术菌株G16X-D的菌落纯化图；图2为本专利技术菌株G16X-D的16SrDNA菌落PCR扩增后的结果图；图3为本专利技术菌株G16X-D与其他菌株的亲缘关系图；图4为本专利技术菌株G16X-D在不同COD(葡萄糖)/N条件下的反硝化能力；图5为本专利技术菌株G16X-D在不同初始pH条件下的反硝化能力；图6为本专利技术菌株G16X-D在不同温度条件下的反硝化能力；图7为本专利技术菌株G16X-D在不同初始NO3——N浓度条件下的反硝化能力；图8为本专利技术菌株G16X-D在pH值为4.5的条件下的反硝化作用；图9为本专利技术菌株G16X-D在实际酸性矿山废水中的硝酸盐的去除率；图10为本专利技术菌株G16X-D在实际酸性矿山废水处理过程中pH的变化。具体实施方式下面将结合本专利技术中的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：耐酸性反硝化菌(Pseudomonasaeruginosa)G16X-D的选育本专利技术的耐酸性反硝化菌(Pseudomonasaeruginosa)G16X-D是自我国新疆某砂岩型铀矿地下水中分离纯化得到的。将地下水样品按20％接种到pH值为5.0～5.5的反硝化培养基中，在30～35℃条件下静置富集培养，每隔2天测定培养液中的硝酸根离子浓度，当硝酸根离子去除了90％以上后，将其按1％接种到第二批反硝化培养基中，继续测定培养液中的硝酸根离子，经过反复多批次驯化培养直到培养液中的硝酸根离子能在3～5天内降低90％以上，按照平皿夹层厌氧法在平板上稀释涂布进行分离，得到单菌落后，进行多次划线纯化，直到平板上菌落的形态特征基本相同，则视为纯菌，菌落纯化照片见图1。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐酸性反硝化菌，其微生物保藏编号为CGMCC NO.13108。

【技术特征摘要】
1.一种耐酸性反硝化菌，其微生物保藏编号为CGMCCNO.13108。2.权利要求1所述耐酸性反硝化菌在酸性水体中的应用，其特征在于，所述耐酸性反硝化菌在酸性水体中进行硝酸盐脱氮。3.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述酸性水体的pH值在4.5以上。4.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述耐酸性反硝...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘亚洁，陈竹争，李泽斌，徐玲玲，安凯，胥亮，李江，王学刚，孙占学，吴静琳，郑福存，
申请(专利权)人：东华理工大学，
类型：发明
国别省市：江西,36