一种反硝化细菌及其发酵生产方法技术

本发明专利技术涉及微生物发酵工程技术领域内能有效利用无机氮源、抑制硫酸盐还原菌（SRB）生长繁殖的一种反硝化细菌及其发酵生产方法，本发明专利技术的高温反硝化细菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委托员会普通微生物保藏中心，拉丁文学名为Geobacilluspallidas，保藏编号为CGMCCNO7270保藏日期为2013年3月5日。本发明专利技术的高温反硝化细菌能有效利用无机氮源，可以在45℃—90℃高温条件下有效抑制SRB的生长繁殖，发酵工艺简单，可一次发酵成功，并且培养基成本低，培养周期短，生产的反硝化细菌活菌含量及芽胞率高，单位活芽胞含量达2×108cfu/mL，芽孢含量90%以上。

【技术实现步骤摘要】
一种反硝化细菌及其发酵生产方法
本专利技术涉及微生物发酵工程
，特别涉及一种能有效利用无机氮源、抑制硫酸盐还原菌（SRB）生长繁殖的反硝化细菌及其该反硝化细菌的发酵生产方法。
技术介绍
油藏注水开发导致原油生物降解及其降解的中间产物，刺激了油藏、石油管道及采油装置中的硫酸盐还原菌（SRB）的生长。硫酸盐还原菌产生大量的硫化氢，造成油藏酸化及管道的腐蚀，给全球石油工业带来了严重的损失。美国和西德科研机构最近的数据表明：SRB腐蚀仅对油田矿厂供水系统造成的损失就达7亿美元/年，对油田保持地层压力系统和矿场回收利用污水系统造成的损失就更为严重。我国大部油田如四川油气田，大庆、辽河、吉林等油田都不同程度地受到SRB腐蚀的危害，其中以四川油气田受SRB腐蚀之害最深，曾先后发生过多起因应力腐蚀引起的恶性事故。防止SRB腐蚀已是腐蚀科学和微生物学和工业系统共同关注的重要课题。目前，投入杀菌剂是最常用的防治SRB腐蚀的方法。但SRB种类繁多，化学杀菌剂能够波及到也难于全面捕杀；同时杀菌剂的大量使用，可使细菌产生耐药性，也会给环境带来污染负荷。近年来，利用微生物来抑制或消除微生物腐蚀的研究已经受到普遍的关注，应用最为广泛的是用硝酸盐还原菌NRB（亦称反硝化细菌）作用来抑制硫酸盐还原菌的生长或产物的积累，减轻或抑制腐蚀的发生。反硝化细菌在生活习性、生长环境等方面与硫酸盐还原菌非常相似，只是它们不产生H2S，而生成其它对油田无害的产物或者将H2S转化，降低SRB的腐蚀。这些细菌注入地层中，可以与SRB发生竞争，使SRB的生长繁殖受到抑制，即利用微生物之间的竞争关系来防止SRB腐蚀。该方法在不破坏环境的条件下，利用系统本身微生物的竞争生长规律治理腐蚀菌，或利用微设备危害较小，成本相对较底，因而是今后研究工作的重点。但现有技术中用于抑制硫酸盐还原菌的反硝化细菌均是中低温范围下使用的，最佳工作温度一般是20—30℃只能应用于油田地面污水处理系统，而油井和油藏等高温环境下传统的反硝化细菌并没有任何效果；并且反硝化菌种需经多次放大发酵才能发酵成适用工业应用菌液，发酵工艺繁琐，能源消耗高。因此，目前大部分反硝化细菌进行SRB的防治基本停留于室内研究或者小试阶段。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中反硝化细菌抑制SRB的最佳温度低，菌液的工业发酵程序繁琐、能耗高的问题，提供一种反硝化细菌，以提高反硝化细菌抑制SRB的抑制温度，并且可以简化反硝化细菌工业发酵过程。本专利技术的反硝化细菌，为JSHD01地芽孢杆菌，具有序列表SEQIDNO：1所示的序列，保藏于中国微生物菌种保藏管理委托员会普通微生物保藏中心，拉丁文学名为Geobacilluspallidus，保藏编号为CGMCCNO7270保藏日期为2013年3月5日。本专利技术还提供上述高温反硝化细菌的发酵生产方法，包括如下步骤：1)将所述CGMCCNO7270反硝化细菌接种在固体培养基上，50℃—60℃静止培养3-4天以形成反硝化细菌芽胞；2）将步骤1）中培养过的固体培养基表面用无菌水洗涮，获得反硝化细菌孢子悬浮液，显微镜镜检计数芽胞含量>1×1010cfu/mL；将悬浮液经70-75℃水浴10-15min以获得发芽势强、发育一致的孢子悬浮液作为发酵生产菌种；3）将步骤2）中孢子悬浮液生产菌种按100mL接种2000L—2400L无菌培养基的比例接种到发酵罐中进行放大培养，发酵控制条件为：接种温度63-65℃，培养温度55-60℃，罐压0.01-0.05Mpa，发酵过程中向培养基中通入经除尘杀菌后的空气，每分种通入的空气量为液体体积的0.2—0.3倍，搅拌速度为150-250rpm；发酵培养35-45h，取样镜检90%以上菌体产生芽孢后，再收集菌液获得反硝化细菌产品，所述硝化细菌产品的单位活芽胞量大于2×108cfu/mL。上述步骤1）中固体培养基的配方及各组分的质量百分比为：硝酸钠0.15-0.2%，乙酸钠0.075-0.1%，磷酸二氢钾0.05-0.1%，葡萄糖0.075-0.1%，硫酸镁0.01-0.02%，天冬氨酸0.04-0.05%，三氯化铁0.005-0.01%，酵母膏0.01-0.012%，琼脂1.5-2.0%，余量为水，pH值7.0-7.2。上述步骤3）中无菌培养基的配方及各组分的质量百分比为：硝酸钠0.15-0.2%，乙酸钠0.075-0.1%，磷酸二氢钾0.05-0.1%，葡萄糖0.075-0.1%，硫酸镁0.01-0.02%，天冬氨酸0.04-0.05%，三氯化铁0.005-0.01%，酵母膏0.01-0.012%，泡敌0.05-0.1%，余量为水，pH值7.0-7.2。本专利技术的高温反硝化细菌为地芽孢杆菌，能有效利用无机氮源，可以在45℃—90℃高温条件下有效抑制SRB的生长繁殖，发酵工艺简单，可一次发酵成功，并且培养基成本低，培养周期短，生产的反硝化细菌活菌含量及芽胞率高，单位活芽胞含量达2×108cfu/mL，芽孢含量90%以上。生物保藏本专利技术所涉及的微生物已提交生物保藏：实施例1本专利技术的JSHD-1反硝化细菌的筛选步骤如下：（1）样品采集在江苏油田采集3口油井的产出液，样品名称分别为：富129、富137、富146。（2）培养基配置富集培养基由A溶液和B溶液混合组成，其中：A溶液：无机盐K12.0g，天冬酰胺1.0g，蒸馏水500ml，pH值7.0~7.2；B溶液：柠檬酸钠8.5g，乙酸钠2g，葡萄糖2g，KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O1.0g，FeCl3·6H2O0.05g，CaCl20.1g，yeastextract0.5g，蒸馏水500ml。pH值7.0~7.2。NRB液体培养基：A液和B液单独121℃灭菌20min，灭菌后等比例混合。NRB固体培养基：A液和B液中各加入质量比为1.5%~2%的琼脂，单独灭菌后等比例混合。（3）富集培养将江苏油田3口油井产出液样品等比例混合，然后加入NRB液体培养基，分别置于65℃、75℃培养箱中好氧培养；同时，以同样处理的采出液灭菌样品做为对照样。65℃条件下培养6d后以5%的接种量接种至相同的NRB液体培养基中进行转接培养，培养3d后再次转接，转接培养3次，然后转接至70℃条件下进行驯化培养。培养后测定培养液中K1离子浓度见表1。经过三次转接，65℃、70℃条件下培养溶液浑浊，而对照样培养液澄清，表明实验组培养液中微生物大量生长，同时，由表1培养液K1浓度测定表明，70℃驯化培养2d，K1浓度由2.0g/L降低至0.24g/L，而65℃第三次转接培养液K1浓度测定为0，培养后溶液K1离子浓度大幅度降低说明微生物生长同时伴随K1离子大量消耗，表明实验组培养液含有硝酸盐还原菌，且在实验条件下生长旺盛。（4）菌株分离纯化将65℃三次转接、70℃驯化的反硝化细菌样品涂布到NRB固体培养基平板培养，培养1d后平板上NRB的菌落如图1所示。培养平板上的反硝化细菌菌落一部分是乳白色的圆形扁平菌落，边缘整齐，表面光滑、粘稠；一部分是不规则形状、边缘呈叶状的台状菌落，菌落呈乳白色，表面光滑、粘稠。从所得培养平板上挑取单菌落于三角烧瓶的NRB液体培养基中进行培养，培养3d后置于4℃条件下保存。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种反硝化细菌，其特征在于，为JSHD01地芽孢杆菌，具有序列表SEQ ID  NO：1 所示的序列，保藏于中国微生物菌种保藏管理委托员会普通微生物保藏中心，拉丁文学名为 Geobacillus pallidas，保藏编号为CGMCC NO 7270 保藏日期为 2013年3月5日。

【技术特征摘要】
1.一种反硝化细菌，其特征在于，为JSHD01地芽孢杆菌，具有序列表SEQIDNO：1所示的序列，保藏于中国微生物菌种保藏管理委托员会普通微生物保藏中心，拉丁文学名为Geobacilluspallidus，保藏编号为CGMCCNO7270保藏日期为2013年3月5日。2.一种权利要求1所述的反硝化细菌的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将所述CGMCCNO7270反硝化细菌接种在固体培养基上，50—60℃静止培养3-4天以形成反硝化细菌芽胞；2）将步骤1）中培养过的固体培养基表面用无菌水洗涮，获得反硝化细菌孢子悬浮液，显微镜镜检计数芽胞含量>1×1010cfu/mL；将悬浮液经70-75℃水浴10-15min以获得发芽势强、发育一致的孢子悬浮液作为发酵生产菌种；3）将步骤2）中孢子悬浮液生产菌种按100mL接种2000L—2400L无菌培养基的比例接种到发酵罐中进行放大培养，发酵控制条件为：接种温度63-65℃，培养温度55-60℃，罐压0.01-0.05Mpa，发酵过程中向培养基中通入经除尘杀菌后的空气，每分种通入的空气量为液体体积的0.2—0.3倍，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴伟林，杨海滨，姚峰，林晶晶，孟章进，杨帆，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，中国石油化工股份有限公司江苏油田分公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32