一种木麻黄青枯菌溢出分离的方法技术

本发明专利技术公开了一种木麻黄青枯菌溢出分离的方法，该方法包括以下步骤：挖取8～15cm长的木麻黄病根，洗净，两端切成平整的新鲜断面；然后把其中一端的3～5cm浸泡于无菌水中，4～12h后，在木麻黄病根的另一端断面流出乳白色的菌脓；用接种针挑取菌脓划线培养于细菌培养基上，选择分离出的典型单菌落进行扩大培养。所述木麻黄青枯菌溢出分离的方法具有操作容易，简便快速，可靠性强，杂菌含量低的优点。

Method for overflowing and separating Casuarina solanacearum

The invention discloses a method for Casuarina R.solanacearum overflow separation, the method comprises the following steps: digging 8 ~ 15cm long Casuarina equisetifolia root cause, wash, cut into two flat and put fresh section; wherein one end of the 3 ~ 5cm soaked in sterile water, 4 ~ 12h, on the other end section the root cause of the outflow of Casuarina milk white pus bacteria; bacteria were inoculated with needle pus cultured in crossed bacterial culture medium, selection of typical single colonies were isolated from the expanding culture. The method for separating and separating the Ralstonia solanacearum of the Casuarina equisetifolia has the advantages of easy operation, simple and fast, high reliability and low content of miscellaneous bacteria.

【技术实现步骤摘要】
一种木麻黄青枯菌溢出分离的方法
本专利技术属于生物
，具体是涉及一种木麻黄青枯菌溢出分离的方法。
技术介绍
目前木麻黄(Casuarina)青枯菌(Ralstoniasolanacearum)的分离一般采用植物细菌分离常规方法——稀释分离法。稀释分离法是植物细菌分离常规方法，长期以来应用于木麻黄青枯病菌的分离。其技术原理：自然条件下，木麻黄青枯菌从根系的根冠部位侵入，经细胞间隙侵入根系木质部的维管束，在根系维管束中大量繁殖、扩散，最终堵塞维管束中的液流运输造成植株死亡，稀释分离法取病根后，在无菌条件下清洗、剥去外皮均是为了避免杂菌污染，再将病根垂直于维管束将其切碎浸于水中，这时候生长于维管束中的青枯菌就会被释放出来。TTC培养基由于含有2,2,3-三苯基四唑氯，能与青枯菌发生显色反应，成为植物青枯病菌的选择性培养基，即利用TTC培养基特异性区分青枯菌和其他细菌，并根据菌落生长形态来判断其致病性的强弱。木麻黄青枯病菌稀释分离法具体的操作是：挖取10～12cm木麻黄新鲜病根，在流水下刷洗，去除病根表面泥垢。在超净工作台上将病根剪成2～3cm长，75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，剥去外皮，切除两端，最后垂直维管束将其切碎，放入含有5～10ml无菌水的培养皿内30min，病菌从病根中释放扩散到水中，形成悬浮液。用移植环蘸取菌液划线培养于TTC培养基上，利用青枯菌对TTC培养基的显色反应进行木麻黄青枯菌株的鉴定及毒性鉴别。上述稀释分离法虽然长期运用于木麻黄青枯病菌的分离，但仍存在以下缺点：1.操作复杂。需要对病根表面进行清洗、消毒、剥皮、切碎、浸泡等一系列步骤程序才能完成。2.操作难度大。由于青枯菌生长繁殖于维管束组织中，需要横切根系才能稀释分离出病菌，但木麻黄根系木材密度大，细胞致密，切断切碎根系费劲、费时；其次，根系外层树皮含杂菌多，为保证分离效果需要将根系外皮剥除，外皮与根系木质部紧密连结，剥除过程操作难度大。3.杂菌含量较高，通常需要二次分离。有些病根维管束中含有较多腐生性菌或者分离过程操作不当，均会造成分离出的青枯菌中杂菌含量多，这时不能直接扩大培养，还应挑取典型菌落进行二次分离。4.利用TTC培养基传统肉眼观察判断毒性菌株的方法可靠性较差。由于木麻黄青枯菌株混杂，菌系变异快，致病性分化严重，TTC培养基作为一种半选择性培养基用于特异性区分青枯菌和其他细菌，并根据菌落生长形态来判断其致病性的强弱存在误差。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种木麻黄青枯菌溢出分离的方法，该方法具有操作简单，分离成功率高，杂菌含量低的优点。其技术方案如下：一种木麻黄青枯菌溢出分离的方法，包括以下步骤，(1)挖取8～15cm长的木麻黄病根，洗净，两端切成平整的新鲜断面；(2)然后把其中一端的3～5cm浸泡于无菌水中，4～12h后，在木麻黄病根的另一端断面流出乳白色的菌脓；(3)用接种针挑取菌脓划线培养于细菌培养基上，选择分离出的典型单菌落进行扩大培养。优选地，步骤(1)中，挖取的木麻黄病根10～12cm长，洗净，两端切成平整的新鲜断面；步骤(2)中，浸泡6～8h。优选地，还包括对扩大培养的细菌进行16srRNA测序鉴定。更进一步地，所述6srRNA测序鉴定的扩增引物为：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。优选地，所述木麻黄病根为新近发病病株的病根，进一步地，其根系木质部呈透明水渍状，浅褐色，植株地上部50～70％小枝黄化，稀疏、凋落的。本专利技术所述木麻黄青枯菌溢出分离方法具有以下优点：1.为木麻黄青枯菌的分离提供了一种新方法。2.操作步骤简化：只需把病根一端浸泡于无菌水中就可以挑取菌脓，无需消毒，切根、剥皮等操作，提高工作效率。3.操作容易：只要将病根洗净、两端切出新鲜断面，一端浸泡后就可得到新鲜菌脓。利用植物维管束毛细现象，病根浸泡时不用区分生理下端和生理上端，均能在另一端溢出乳白色至黄褐色的细菌脓液，简单容易。4.对操作人员技术要求低：除了挑取菌脓，分离全过程无需在超净工作台上进行，无需具备熟练的无菌操作能力。5.杂菌含量低，通常无需二次培养，直接用于扩大培养。溢出的菌脓多为新鲜病菌，直接挑取，病菌活力强，分离成功率高，杂菌含量低。6.进一步地，利用16SrRNA基因检测技术对分离出的青枯菌进行测序鉴定，大大提高了对分离出的青枯菌检测和鉴定的可靠性。综上所述，本专利技术利用木麻黄青枯菌入侵、繁殖及扩张特点，经过专利技术人长期的研究，在传统木麻黄青枯菌稀释分离法基础上进行独特的技术创新，专利技术了木麻黄青枯菌溢出分离法。与传统稀释分离方法相比，本专利所述的分离方法具有操作容易，简便快速，可靠性强，杂菌含量低的优点，从而为木麻黄青枯菌的分离提出了一种新的有效方法。附图说明图1为部分菌株16SrRNA序列扩增电泳检测结果；图2为M-16SrRNA序列与GenBank中一种青枯菌16SrRNA序列的比较。具体实施方式自然条件下，木麻黄青枯菌从根系的根冠部位侵入，经细胞间隙侵入根系木质部的维管束并大量繁殖，在植株蒸腾作用下侵入的青枯菌随着液流在导管及其邻近组织内扩散，最终堵塞维管束中的液流运输造成植株死亡。本专利技术利用溢出法能成功分离出青枯菌的原理在于：挖取的新近发病植株的病根，其维管束中不仅含有大量青枯菌，且维管束结构未遭彻底破坏，这些维管束就是植物体内的极细的毛细管，在毛细管作用下(毛细现象)它能把水分吸上来。将病根一端浸泡于水中后，维管束吸收水分，生长在维管束里面的青枯菌随着液流向上运输，最终会在病根另一端溢出青枯菌脓。所述木麻黄青枯菌溢出分离方法，包括挖取10～12cm长的木麻黄病根，洗净，两端切成平整的新鲜断面，然后把其中一端3～5cm浸泡于无菌水中，6～8h后，在病根的另一端断面会流出乳白色的菌脓。用接种针挑取菌脓划线培养于细菌培养基上。选择分离出的典型单菌落进行扩大培养并进行16srRNA测序鉴定。具体操作过程需要注意以下几点：(1)挖取的病根为新近发病病株的根系，肉眼判断标准为根系木质部呈透明水渍状，浅褐色，植株地上部50～70％小枝黄化，稀疏、凋落。发病时间太长的病根木质部呈深褐色或黑褐色，植株地上部完全黄化干枯，这时病根内含腐生菌较多，分离时杂菌含量增多，有些病根甚至开始腐化，维管束结构遭到破坏，维管束的毛细管作用遭到破坏，不利于青枯菌脓的溢出；发病时间太短的病根则因为青枯菌繁殖数量不够，也难于溢出青枯菌脓。(2)试验室内浸泡病根时不用区分生理下端和生理上端。在自然状态下青枯菌侵入根系维管束后随着蒸腾液流在导管及其邻近组织内繁殖扩散，但本专利技术利用的是植物维管束毛细管作用原理，维管束吸收水分，通过树液的流动将青枯菌脓送到病根的另一端，因此无论病根的生理下端还是生理上端浸泡于水中，均能发生毛细现象，均能在另一端溢出乳白色至黄褐色的细菌脓液。(3)浸泡病根用无菌水，避免杂菌污染。本专利技术是利用维管束毛细管作用吸收水分，促进树液流动，使生长在维管束中的青枯菌溢出。由于普通自来水中含有各种微生物，为了保证溢出青枯菌的纯度，使用无菌水来浸泡病根为最佳。(4)及时挑取溢出的菌脓进行划线培养。由于不同病株根系组织材质致密程度不同、感病时间长短不同或维管束中青枯菌含量不同等原因会造成病根溢出菌脓的速度不同，一旦溢本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种木麻黄青枯菌溢出分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)挖取8～15cm长的木麻黄病根，洗净，两端切成平整的新鲜断面；(2)然后把其中一端的3～5cm浸泡于无菌水中，4～12h后，在木麻黄病根的另一端断面流出乳白色的菌脓；(3)用接种针挑取菌脓划线培养于细菌培养基上，选择分离出的典型单菌落进行扩大培养。

【技术特征摘要】
1.一种木麻黄青枯菌溢出分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)挖取8～15cm长的木麻黄病根，洗净，两端切成平整的新鲜断面；(2)然后把其中一端的3～5cm浸泡于无菌水中，4～12h后，在木麻黄病根的另一端断面流出乳白色的菌脓；(3)用接种针挑取菌脓划线培养于细菌培养基上，选择分离出的典型单菌落进行扩大培养。2.根据权利要求1所述的木麻黄青枯菌溢出分离的方法，其特征在于，步骤(1)中，挖取的木麻黄病根10～12cm长，洗净，两端切成平整的新鲜断面；步骤(2)中，浸泡6～8h。3.根据权利要求1所述的木麻黄青枯菌溢出分离的方法，其特征在于，还包括对扩大培养的细菌进行16srRNA测序鉴定。...

【专利技术属性】
技术研发人员：许秀玉，徐斌，王明怀，甘先华，张卫强，黄钰辉，温小莹，周毅，郭乐东，黄芳芳，
申请(专利权)人：广东省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44