越南槐内生真菌TRXY-46在防治三七黑斑病中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种越南槐内生真菌TRXY-46，越南槐内生真菌TRXY-46的分类命名为Rhexocercosporidium sp.TRXY-46，菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1所述，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2014年12月03日，保藏号：CGMCC No.10108。本发明专利技术首次从药用植物越南槐的根中分离筛选到一株内生真菌(Rhexocercosporidium sp.)TRXY-46，该菌对三七黑斑病菌具有很强的抑制作用，为三七真菌病害的生物防治领域带来广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种越南槐内生真菌TRXY-46在防治三七黑斑病中的应用。
技术介绍
现代农业对植物病害的防治过度依赖于化学农药的使用，大量化学农药的施放不仅对生态环境具有长期的破坏作用，也引起农产品品质下降，农药残留超标、病原菌的耐药性以及对人畜有害等诸多问题。寻找更为安全、有效的病害防治方法具有重大的意义，利用生物的方法来防治植物病害可以有效解决上述问题。三七(PanaxnotoginsengF.H.chen)又名田七、金不换等，具有显著的活血化瘀、消肿定痛功效，是一种中国传统名贵药材。以三七为主要原料制成的中成药如“云南白药”和“片仔癀”等广为流传。近年来，对三七原材料的需求日益增长。但是栽培过程中的真菌病害严重影响了三七生长。目前，在三七种植上，防治真菌病害过度依赖化学农药，大量化学农药的使用不仅影响了三七的品质，也造成了三七药材的大量农药残留。三七黑斑病能侵染三七植株和地下根系，以茎、叶、花轴受害较重，根部感染后呈褐色湿腐状，四季均可发生，三七园棚内温度高、湿度大，施肥不当都有可能使病害蔓延加重，一般常年发病率在5％-20％之间，严重时高达60％以上。其症状大都由三七黑斑病菌AlternariapanaxWhetzel(简称A.panax)危害所致。这个真菌病害是造成多年来三七产品质量和产量下降的主要原因之一。在广西三七的传统道地产区，由于低海拔及高温多湿的气象条件，这种病害往往是同时发生的，造成了三七的大量减产甚至绝收，给种植户带来了巨大的经济损失。为了控制这个真菌病害，大量的化学农药被使用，造成了三七产品的大量农药残留，严重的污染了环境，大大的威胁了人们的健康。因此，开展生物防治三七真菌病害对三七产业的可持续发展是非常迫切和必要的。为此筛选出能同时拮抗这种病害的拮抗菌具有重大意义，筛选进而开发利用拮抗菌也是有效控制三七真菌病害最具发展潜力的防治措施之一。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种越南槐内生真菌TRXY-46在防治三七黑斑病中的应用，从而能有效的防治三七种植过程中出现的三七黑斑病，从而提高三七的产量以及质量。为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：一种越南槐内生真菌TRXY-46，越南槐内生真菌TRXY-46的分类命名为Rhexocercosporidiumsp.TRXY-46，菌株的ITS序列如SEQIDNO.1所述，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2014年12月03日，保藏号：CGMCCNo.10108。优选的是，所述越南槐内生真菌TRXY-46代谢产物的制备方法为：(1)将越南槐内生真菌TRXY-46接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平面皿(PDA平板)中，置于温度为28℃下培养20天，所得培养材料切成块状并转移到无菌固体培养基中，置于28℃发酵60天；(2)发酵完成后，用发酵物2倍的甲醇浸泡发酵物并超声40min，然后过滤；(3)重复步骤(2)两次，合并两次滤液进行减压浓缩成浸膏，得到内生真菌TRXY-46发酵物的甲醇粗提物，即为越南槐内生真菌TRXY-46代谢产物。优选的是，步骤(1)中所述的无菌固体培养基含400g马铃薯，20g的右旋糖和20g蔗糖。如上述制备所得越南槐内生真菌TRXY-46的代谢产物在防治三七黑斑病中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术首次从药用植物越南槐的根中分离筛选到一株内生真菌(Rhexocercosporidiumsp.)TRXY-46，该菌对三七黑斑病菌具有很强的抑制作用，为三七真菌病害的生物防治领域带来广阔的应用前景。附图说明图1是本专利技术越南槐内生真菌TRXY-46与三七黑斑病的平板对峙培养，其中F为三七黑斑病菌(AlternariapanaxWhetzel)，a为空白对照，b为实验组。图2是本专利技术越南槐内生真菌TRXY-46菌株形态特征。图3为越南槐内生真菌TRXY-46菌株基于ITS序列的系统进化树。图4是根据本专利技术菌株越南槐内生真菌TRXY-46的代谢产物对三七黑斑病菌的菌丝生长的抑制效果；其中第1、第5个为空白对照即不含药的PDA平板；第2、第3、第4个为阳性对照多菌灵粉剂；第6、第7、第8为菌株的代谢产物，且浓度分别为2mg/ml，4mg/ml，8mg/ml；L为三七黑斑病菌AlternariapanaxWhetz。具体实施方式下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。甲醇为市购分析纯甲醇。2XTagMasterMix购自宝生物工程有限公司(Takara)，Primer-1、Primer-2由华大基因合成。实施例1菌株的分离、筛选及鉴定一、菌株的分离供试材料：采自广西天等县石灰岩地区的野生越南槐。供试菌株：由广西大学植物病理研究所提供。培养基：1000ml马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)，PDA培养基含马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g和氯霉素0.1g，培养基pH值为6.0±0.2。表面消毒:将长为6-8cm、宽为1-2cm新鲜健康的越南槐根用流水冲洗30min以冲干净泥沙，然后将洗净的越南槐根用无菌水漂洗2次，风干表面水分，移到超净工作台，在无菌条件下，将越南槐根用体积浓度为75％乙醇浸泡1min，无菌水漂洗2次，次氯酸钠(有效氯1％)浸泡2min，无菌水洗3次，无菌吸水纸吸干表面备用。菌株的分离、纯化：表面消毒好的越南槐根，无菌条件下，用无菌木片刮去表皮，用无菌枝剪剪去越南槐根的两端，余下部分用无菌小刀和无菌镊子分开木质部和韧皮部，并用无菌枝剪剪成0.5cm长的组织块，无菌转接至制备好的PDA培养基(含氯霉素)，28℃培养。取表面消毒最后一次漂洗液涂布在PDA平板上，作为阴性对照。每天观测，待组织周围长出菌丝，挑取单一菌丝，接于无抗生素的PDA培养基。长出的菌落，如果菌落形态不一致，继续挑取单一菌丝转接PDA培养基，直至平板上新长出的菌落的外部形态一致。将分离到的内生真菌接种于PDA平板内，28℃下培养20天后待用。将三本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种越南槐内生真菌TRXY‑46，其特征在于：越南槐内生真菌TRXY‑46的分类命名为Rhexocercosporidium sp.TRXY‑46，保藏号：CGMCC No.10108。

【技术特征摘要】
1.一种越南槐内生真菌TRXY-46，其特征在于：越南槐内生真菌TRXY-46的分类命名为
Rhexocercosporidiumsp.TRXY-46，保藏号：CGMCCNo.10108。
2.一种如权利要求1所述的越南槐内生真菌TRXY-46的代谢产物的制备方法，其特征在
于，操作步骤如下：
(1)将越南槐内生真菌TRXY-46接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平面皿中，置于温度为
28℃下培养20天，所得培养材料切成块状并转移到无菌固体培养基中，置于28℃发酵60天；

【专利技术属性】
技术研发人员：姚裕群，黄荣韶，吴炫柯，李良波，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45