一种六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法技术

本发明专利技术公开了一种六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法，得到了对六堡茶中真菌在渥堆过程中数量变化情况，渥堆茶堆中，上层、中层、下层的微生物数量差异较大；得到了渥堆过程中的12种不同的真菌菌株；六堡茶渥堆发酵过程中以曲霉属真菌和酵母菌为主；六堡茶渥堆中的优势微生物为黑曲霉和酵母菌。本发明专利技术得到了六堡茶渥堆过程中的真菌菌落数量及菌相的变化，筛选出对渥堆中的优势菌种，初步研究优势菌株对六堡茶发酵的影响，为六堡茶的研究、生产提供理论基础，同时也为改进六堡茶的发酵工艺，研究人工发酵菌剂提供参考，全面揭示了微生物对六堡茶品质、安全、风味的影响，对于优化六堡茶的生产，提高品质有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于六堡茶
，尤其涉及一种六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法。
技术介绍
六堡茶是一种深度发酵的黑茶，具有红、浓、陈、醇的风味特点，因原产于广西梧州市苍梧县的六堡乡而得名，已有一千多年历史，属于我国地理标志产品。长期以来，人们认为六堡茶的品质风味与其生产环境和参与发酵的微生物密切相关。然而，六堡茶中微生物的构成与作用一直未见系统报导。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法，旨在解决目前尚无研究表明六堡茶渥堆过程中的微生物数量及其生长变化情况如何，以及不同堆层的数量差异如何，不利于更好的开发六堡茶价值的问题。本专利技术是这样实现的，一种六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法，该六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法得到了对六堡茶中真菌在渥堆过程中数量变化情况，渥堆茶堆中，上层、中层、下层的微生物数量差异较大，第一次翻堆后，上层微生物酵母、霉菌在全过程数量最大；中层的酵母、霉菌比上、下层的数量要少，酵母菌、霉菌在第4天有1个数量小高峰，然后在第5天第一次翻堆前降低至发酵前的水平，酵母菌和霉菌在第二次翻堆时达到全程的数量最高峰，达2.2×108CFU/g、1.5×107CFU/g，之后均降低至最终渥堆的105CFU/g水平；得到了渥堆过程中的12种不同的真菌菌株：血红密孔菌、茄病镰刀菌、泡盛曲霉、黑曲霉、塔宾曲霉、桔青霉、烟曲霉、赤散囊菌、杂色曲霉、阿姆斯特丹散囊菌、宛氏拟青霉、酵母菌；六堡茶渥堆发酵过程中以曲霉属真菌和酵母菌为主；六堡茶渥堆中的优势微生物为黑曲霉和酵母菌；黑曲霉和泡盛曲霉在降低水浸出物、茶多酚、游离氨基酸、可溶性糖类和改变茶品的感官方面起的作用明显。进一步，该六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法具体包括以下步骤：步骤一，进行六堡茶茶叶真菌DNA的提取、六堡茶茶叶中总DNA提取，然后进行总DNA扩增体系及程序，单个真菌DNA扩增体系及程序，梯度变性梯度凝胶电泳条带扩增体系及程序；步骤二，梯度变性梯度凝胶电泳图谱的分析方法，梯度变性梯度凝胶电泳条带回收方法及序列分析，聚类分析方法，采用人工添加渥堆过程中分离的主要微生物到茶叶中，模拟生产环境中的温度、湿度变化，进行发酵；步骤三，茶叶添加菌种，在百级无菌室中，将菌液混匀至880mL灭菌蒸馏水中，振荡混匀，再均匀加至茶叶中，然后装篓，稍微用力紧压，然后用无菌大塑料袋套住；步骤四，发酵培养，在发酵过程采用生化培养箱辅助升降温，根据生产中温度的变化规律调节，使与生产一致，同时，在生化培养箱中放置有水烧杯以保持湿度，发酵时间与生产一致，为35天；步骤五，对发酵后茶叶进行水分的检测、水浸出物的检测、叶茶多酚的检测、游离氨基酸的检测和可溶性糖的检测。进一步，真菌DNA的提取方法具体包括：从真菌计数中的培养平板，选取生长形态不同的菌株，转移至孟加拉红培养基进行纯培养，待长满培养基表面时，刮取适量菌体至无菌研钵，倒进液氮，用力研磨，反复直至粉末状，取豆粒大粉末转移至1.5mL离心管，加入900μL的真菌DNA提取液，同时加入450μL的氯仿、450μL的Tris-平衡酚，轻轻上下颠倒混匀，10000rpm离心10min，取800μL上清转移至另1灭菌离心管中，加入等量的氯仿，上下颠倒混匀后，10000rpm离心10min，取600μL上清，加入等量的异丙醇沉淀，13000rpm,离心15min，收集的DNA用75％酒精洗涤2遍，加入约30μL的ddH2O溶解，置-20℃保存。进一步，茶叶中总DNA提取方法，从混匀的茶叶里称量至50g，置于500mL的锥形瓶里面，加用灭菌的玻璃珠，再添加0.85％磷酸盐缓冲液450mL，200rpm震荡15min，然后用双层纱布过滤掉茶叶，滤液使用500mL的离心瓶收集，10000rpm离心10min，收集沉淀；采用液氮研磨的方式裂解菌体，将沉淀从离心瓶转移至灭菌的研钵，倒进液氮，用力研磨，反复直至粉末状，转移粉末至50mL离心管，加入15mL的总DNA提取液，同时加入7.5mL的氯仿、7.5mL的Tris-平衡酚，上下颠倒混匀，10000rpm离心10min，取上清转移至另1新离心管中，加入等量的氯仿，上下颠倒混匀后，10000rpm离心10min，取上清，加入等量的异丙醇沉淀，13000rpm,离心15min，收集的DNA用75％酒精洗涤2遍，加入0.3mL的ddH2O溶解，置-20℃保存。进一步，梯度变性梯度凝胶电泳操作步骤：点样：凝胶聚合好后拔掉梳子，用1×TAE清洗胶孔，组装胶板到中心电极后，放入装有电泳缓冲液的电泳槽，加350mL1×TAE到上层缓冲液室，盖上盖子，取下上样盖，即上样，将制备好的样品与等体积的梯度变性梯度凝胶电泳上样缓冲液混匀，用移液器将样品加到胶孔；电泳：先将电泳缓冲液预热至60℃，中心电极放入电泳槽并加样后，盖上加样盖，打开缓冲液泵开关，调电压至180V电泳6h；梯度变性梯度凝胶图谱的分析方法：变性梯度凝胶电泳后的图谱采用BIO-RAD的图像分析软件QuantityOne进行分析；梯度变性梯度凝胶条带回收方法及序列分析：电泳完后用于回收条带的聚丙烯酰胺凝胶用GelRed染料染色，步骤如下：GelRed染料染色30min，去离子水漂洗10s，在紫外灯下用无菌手术刀片切下含有目的片段的胶块，装入1.5mLEP管中；用灭菌枪头将凝胶捣碎，加20μL灭菌双蒸水，放置4℃冰箱过夜；12000rpm离心10min，取1μL上清为模板，用相应特异性引物PCR扩增目的DNA片段；回收的条带用无GC夹板的引物扩增后，送基因公司测序；聚类分析方法，目的条带测序后，在RDP数据库中用Classifier软件包对序列进行归类，并在GeneBank进行序列同源性比较，序列和所比对的同源性高的序列一起，用MEGA5.0beta软件构建系统进化树，系统进化树的构建方法用距离矩阵法中的邻接法。进一步，待发酵茶叶的前处理包括：对实验室内的茶叶，首先将所有的茶叶混合，等分为4份，每份6kg，采用高温灭菌的方式杀灭茶叶中的微生物，成无菌的状态，同时对装压茶叶的竹篓进行杀菌，杀菌温度时间为0.1MPA30min；发酵用菌种的前处理，将分离得到的菌种接种于PDA培养基上进行纯培养，待长满培养基后，使用灭菌棉签将其转移至10mL的0.85％的磷酸盐缓冲液中，浓度均为0.5的麦氏比浊度。进一步，发酵后茶样的制备：将渥堆后的茶叶放紧恒温干燥箱，50℃烘至塑料袋上的水气消失，然后用均质器将其碎，过40目筛，放置于磨沙口瓶备用。进一步，发酵后茶叶水分检测：称量5g粉碎后茶粉于水分测定仪的铝皿中，设定烘干温度为105℃，设备自动运行得出茶叶的水分含量；发酵后茶叶水浸出物的检测：称量2g茶粉，精确至0.0001g，置于500mL烧瓶中，加入2000mL蒸馏水，水浴加热，缓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法，其特征在于，该六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法得到了对六堡茶中真菌在渥堆过程中数量变化情况，渥堆茶堆中，上层、中层、下层的微生物数量差异较大，第一次翻堆后，上层微生物酵母、霉菌在全过程数量最大；中层的酵母、霉菌比上、下层的数量要少，酵母菌、霉菌在第4天有1个数量小高峰，然后在第5天第一次翻堆前降低至发酵前的水平，酵母菌和霉菌在第二次翻堆时达到全程的数量最高峰，达2.2×108CFU/g、1.5×107CFU/g，之后均降低至最终渥堆的105CFU/g水平；得到了渥堆过程中的12种不同的真菌菌株：血红密孔菌、茄病镰刀菌、泡盛曲霉、黑曲霉、塔宾曲霉、桔青霉、烟曲霉、赤散囊菌、杂色曲霉、阿姆斯特丹散囊菌、宛氏拟青霉、酵母菌；六堡茶渥堆发酵过程中以曲霉属真菌和酵母菌为主；六堡茶渥堆中的优势微生物为黑曲霉和酵母菌；黑曲霉和泡盛曲霉在降低水浸出物、茶多酚、游离氨基酸、可溶性糖类和改变茶品的感官方面起的作用明显。

【技术特征摘要】
1.一种六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法，其特征在于，
该六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法得到了对六堡茶中真菌在
渥堆过程中数量变化情况，渥堆茶堆中，上层、中层、下层的微生物数量差异
较大，第一次翻堆后，上层微生物酵母、霉菌在全过程数量最大；中层的酵母、
霉菌比上、下层的数量要少，酵母菌、霉菌在第4天有1个数量小高峰，然后
在第5天第一次翻堆前降低至发酵前的水平，酵母菌和霉菌在第二次翻堆时达
到全程的数量最高峰，达2.2×108CFU/g、1.5×107CFU/g，之后均降低至最终
渥堆的105CFU/g水平；
得到了渥堆过程中的12种不同的真菌菌株：血红密孔菌、茄病镰刀菌、泡
盛曲霉、黑曲霉、塔宾曲霉、桔青霉、烟曲霉、赤散囊菌、杂色曲霉、阿姆斯
特丹散囊菌、宛氏拟青霉、酵母菌；
六堡茶渥堆发酵过程中以曲霉属真菌和酵母菌为主；六堡茶渥堆中的优势
微生物为黑曲霉和酵母菌；黑曲霉和泡盛曲霉在降低水浸出物、茶多酚、游离
氨基酸、可溶性糖类和改变茶品的感官方面起的作用明显。
2.如权利要求1所述的六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法，
其特征在于，该六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法具体包括以
下步骤：
步骤一，进行六堡茶茶叶真菌DNA的提取、六堡茶茶叶中总DNA提取，
然后进行总DNA扩增体系及程序，单个真菌DNA扩增体系及程序，梯度变性
梯度凝胶电泳条带扩增体系及程序；
步骤二，梯度变性梯度凝胶电泳图谱的分析方法，梯度变性梯度凝胶电泳
条带回收方法及序列分析，聚类分析方法，采用人工添加渥堆过程中分离的主
要微生物到茶叶中，模拟生产环境中的温度、湿度变化，进行发酵；
步骤三，茶叶添加菌种，在百级无菌室中，将菌液混匀至880mL灭菌蒸馏
水中，振荡混匀，再均匀加至茶叶中，然后装篓，稍微用力紧压，然后用无菌
大塑料袋套住；
步骤四，发酵培养，在发酵过程采用生化培养箱辅助升降温，根据生产中温
度的变化规律调节，使与生产一致，同时，在生化培养箱中放置有水烧杯以保
持湿度，发酵时间与生产一致，为35天；
步骤五，对发酵后茶叶进行水分的检测、水浸出物的检测、叶茶多酚的检
测、游离氨基酸的检测和可溶性糖的检测。
3.如权利要求2所述的六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法，
其特征在于，真菌DNA的提取方法具体包括：从真菌计数中的培养平板，选取
生长形态不同的菌株，转移至孟加拉红培养基进行纯培养，待长满培养基表面
时，刮取适量菌体至无菌研钵，倒进液氮，用力研磨，反复直至粉末状，取豆
粒大粉末转移至1.5mL离心管，加入900μL的真菌DNA提取液，同时加入450
μL的氯仿、450μL的Tris-平衡酚，轻轻上下颠倒混匀，10000rpm离心10min，
取800μL上清转移至另1灭菌离心管中，加入等量的氯仿，上下颠倒混匀后，
10000rpm离心10min，取600μL上清，加入等量的异丙醇沉淀，13000rpm,离
心15min，收集的DNA用75％酒精洗涤2遍，加入约30μL的ddH2O溶解，
置-20℃保存。
4.如权利要求2所述的六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法，
其特征在于，茶叶中总DNA提取方法，从混匀的茶叶里称量至50g，置于500mL
的锥形瓶里面，加用灭菌的玻璃珠，再添加0.85％磷酸盐缓冲液450mL，200rpm
震荡15min，然后用双层纱布过滤掉茶叶，滤液使用500mL的离心瓶收集，10000
rpm离心10min，收集沉淀；
采用液氮研磨的方式裂解菌体，将沉淀从离心瓶转移至灭菌的研钵，倒进
液氮，用力研磨，反复直至粉末状，转移粉末至50mL离心管，加入15mL的
总DNA提取液，同时加入7.5mL的氯仿、7.5mL的Tris-平衡酚，上下颠倒混
匀，10000rpm离心10min，取上清转移至另1新离心管中，加入等量的氯仿，
上下颠倒混匀后，10000rpm离心10min，取上清，加入等量的异丙醇沉淀，13000
rpm,离心15min，收集的DNA用75％酒精洗涤2遍，加入0.3mL的ddH2O溶

\t解，置-20℃保存。
5.如权利要求2所述的六堡茶渥堆过程中真菌菌群构成与菌种的获取方法，
其特征在于，梯度变性梯度凝胶电泳操作步骤：
点样：凝胶聚合好后拔掉梳子，用1×TAE清洗胶孔，组装胶板到中心电极
后，放入装有电泳缓冲液的电泳槽，加350mL1×TAE到上层缓冲液室，盖上盖
子，取下上样盖，即上样，将制备好的样品与等体积的梯度变性梯度凝胶电泳
上样缓冲液混匀，用移液器将样品加到胶孔；
电泳：先将电泳缓冲液预热至60℃，中心电极放入电泳槽并加样后，盖上
加样盖，打开缓冲液泵开关，调电压至180V电泳6h；
梯度变性梯度凝胶图谱的分析方法：
变性梯度凝胶电泳后的图谱采用BIO-RAD的图像分析软件QuantityOne进
行分析；
梯度变性梯度凝胶条带回收方法及序列分析：
电泳完后用于回收条带的聚丙烯酰胺凝胶用GelRed染料染色，步骤如下：
GelRed染料染色30min，去离子水漂洗10s，在紫外灯下用无菌手术刀片
切下含有目的片段的胶块，装入1.5mLEP管中；
用灭菌枪头将凝胶捣碎，加20μL灭菌双蒸水，放置4℃冰箱过夜；
12000rpm离心10min，取1μL上清为模板，用相应特异性引物PCR扩增
目的D...

【专利技术属性】
技术研发人员：马士成，龙志荣，邱瑞瑾，吴文亮，曹中环，滕翠琴，
申请(专利权)人：梧州市农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45