一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法技术

本发明专利技术属于一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，包括以下步骤：（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种接种平板培养基上，培养，获得活化菌种；（2）发酵培养：将步骤（1）制备的活化菌种接种于培养基B中，温度为25℃条件下静置培养40天，获得发酵物；培养基B的配方为：50~70 g大米，100 ml水；（3）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤（2）制备的发酵物用乙酸乙酯浸取，得提取液，在温度30～34℃，真空度0.07～0.08MPa下减压回收乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；（4）可皆霉素的制备：将步骤（3）制备的乙酸乙酯提取物上柱分离，得可皆霉素。本发明专利技术的提取方法简单易行，成本更低，并具有可持续性。

【技术实现步骤摘要】
一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法
本专利技术属于可皆霉素生产
，具体涉及一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法。
技术介绍
狭旋毛壳属于子囊菌门毛壳属真菌，具有重要的经济学价值和生态意义。研究表明：毛壳菌作为生防菌能够应用于植物病害的防治。可皆霉素(Cochliodinol，分子式为C32H30N2O4；分子量：506.22；CAS登录号：11051-88-0)仅在毛壳属（Chaetomiumglobosum,C.cochliodes）中分离得到，其结构式为：。Brewerr的科研团队发现，在1-10μg/ml时，可皆霉素抑制多属真菌的生长，并能抑制真菌Botrytisallii和Fusarirmmoniliforme孢子的萌发，其形成三乙胺盐后，水溶性显著增加，且溶解后能显著抑制多种微生物质的生长；同时发现可皆霉素在低浓度时，能够抑制多种镰刀菌的生长，而镰刀菌可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物多种病害，造成作物大量死亡，是生产上防治最具挑战性的病害之一。由此可见，其在植物病害防治方面的潜在应用价值非常大。另外，Casellada等研究发现可皆霉素具有显著细胞毒性，可以抑制人口腔上皮癌细胞KB和乳腺癌细胞MDA-MB-435的增殖，IC50分别为0.53μM、2.20μM。综上所述，可皆霉素具有多种生物活性，但由于合成成本高，得率低，无法获得大量纯品，难以进行更深入研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种生产成本低、产量高的利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是，一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种接种平板培养基上，培养，获得活化菌种；（2）发酵培养：将步骤（1）制备的活化菌种接种于培养基B中，温度为25℃条件下静置培养40天，获得发酵物；培养基B的配方为：50~70g大米，100ml水；培养基B的制备方法如下：将大米和水按比例混合，121℃下高压灭菌40分钟；（3）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤（2）制备的发酵物用乙酸乙酯浸取，得提取液，在温度30～34℃，真空度0.07～0.08MPa下减压回收乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；（4）可皆霉素的制备：将步骤（3）制备的乙酸乙酯提取物上柱分离，得可皆霉素。步骤（1）所用的狭旋毛壳菌种保藏的分类学名称为狭旋毛壳(Chaetomiumangustispirale)CLC001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2016年4月28日，保藏号为CCTCCNO：M2016231。该菌在发酵过程中代谢产出大量可皆霉素。该菌的18SrDNA如序列表所示，即CGTGGGTCTTTCTACCTGATCCGAGGTCACCTTGGGTTAAAAGGTGGTTTAACGGCCGGAACCCGCAGCACGCCCAGAGCGAGATGTATGCTACTACGCTCGGTGTGACAGCGAGCCCGCCACTGCTTTTCAGGGCCTGCGGCAGCCGCAGGTCCCCAACACAAGCCCGGGGGCTTGATGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTTATTCAGTACAGAAGACTCAGAGAGGCCATAAATTAACAAGAGTTTGGTGACCTCCGGCGGGCGCCCGCGGTGGGGCCCAGGGGCGCCCGGGGGGTAAACCCCGGGGCCGCCCGCCGAAGCAACGGTTTAGGTAACGTTCACAATGGTTTAGGGAGTTTTGCAACTCTGTAATGATCCCTCCGCAGGTCCCCCTACGGAAG。所述步骤（4）中上柱分离的具体步骤如下：用80～100目硅胶拌样后装柱，固定相为200～300目硅胶，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为100:（2～4）的流份，30～40℃下减压回收二氯甲烷和甲醇，再用二氯甲烷－甲醇体积比为1：1混合溶剂溶解，经SephadexLH-20层析，流动相二氯甲烷－甲醇体积比为1：1，得可皆霉素。所述步骤（1）中平板培养基配方为：酵母膏10g/L，葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，琼脂粉20g/L，pH6.0±0.1。所述步骤（3）中将发酵物用乙酸乙酯浸取时的工艺条件如下：加入乙酸乙酯，20～25℃下冷浸12h，用纱布过滤，得到乙酸乙酯提取液，反复提取3次，合并提取液。所述步骤（4）中将乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶拌样时，乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶的重量比为1︰2。本专利技术产生的有益效果是：本专利技术中提供的狭旋毛壳(Chaetomiumangustispirale)CLC001可在发酵过程中代谢产出大量可皆霉素；本专利技术的提取方法简单易行，相对于其它培养基，该方法成本更低，并具有可持续性，提取得到可皆霉素单体，提取过程中用到的溶剂可回收利用，提取量大，可工业化生产。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术的保护范围不限于此。实施例1一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种（保藏的分类学名称为狭旋毛壳CLC001，保藏号为CCTCCNO：M2016231，保藏于中国典型培养物保藏中心）接种到90mm平板培养基上，25℃恒温培养72小时，获得活化菌种；（2）发酵培养：将步骤（1）制备的活化菌种用手术刀片将其分为12份，取一份接种于培养基B中，温度为25℃条件下静置培养40天，获得发酵物；培养基B的配方为：60g大米，100ml水；培养基B的制备方法如下：将大米和水按比例混合，121℃下高压灭菌40分钟；（3）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤（2）制备的发酵物用乙酸乙酯浸取（加入乙酸乙酯300ml，20～25℃下冷浸12h，用纱布过滤，得到乙酸乙酯提取液，反复提取3次，合并三次的提取液），得提取液，在温度30～34℃，真空度0.07～0.08MPa下减压回收乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；通过HPLC检测，可皆霉素在乙酸乙酯提取物中的含量为68.90%；（4）可皆霉素的制备：将步骤（3）制备的乙酸乙酯提取物用80～100目硅胶拌样后装柱（乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶的重量比为1︰2），固定相为200～300目硅胶，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脱(二氯甲烷－甲醇体积比为100:0；100:1；100:2；100:4；100:8)，硅胶薄层层析，紫外254nm检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为100:2和100:4的流份，40℃下减压回收二氯甲烷和甲醇，再用二氯甲烷－甲醇体积比为1：1的混合溶剂溶解，经SephadexLH-20（羟丙基葡聚糖凝胶）层析，流动相二氯甲烷－甲醇体积比为1：1，得纯品可皆霉素400mg（纯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种接种平板培养基上，培养，获得活化菌种；（2）发酵培养：将步骤（1）制备的活化菌种接种于培养基B中，温度为24~26℃条件下静置培养38~42天，获得发酵物；培养基B的配方为：50~70 g大米，100 ml水；（3）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤（2）制备的发酵物用乙酸乙酯浸取，得提取液，减压回收乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；（4）可皆霉素的制备：将步骤（3）制备的乙酸乙酯提取物上柱分离，得可皆霉素。

【技术特征摘要】
1.一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种接种平板培养基上，培养，获得活化菌种；（2）发酵培养：将步骤（1）制备的活化菌种接种于培养基B中，温度为24~26℃条件下静置培养38~42天，获得发酵物；培养基B的配方为：50~70g大米，100ml水；（3）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤（2）制备的发酵物用乙酸乙酯浸取，得提取液，减压回收乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；（4）可皆霉素的制备：将步骤（3）制备的乙酸乙酯提取物上柱分离，得可皆霉素。2.如权利要求1所述利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，步骤（1）所用的狭旋毛壳菌种保藏的分类学名称为狭旋毛壳CLC001，保藏号为CCTCCNO：M2016231，保藏于中国典型培养物保藏中心。3.如权利要求1所述利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，所述步骤（2）中培养基B的制备方法如下：将大米和水按比例混合，121℃下高压灭菌40分钟。4.如权利要求1所述利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈林，郭庆丰，马经纬，康文艺，
申请(专利权)人：黄河科技学院，
类型：发明
国别省市：河南,41