来自致病杆菌的杀昆虫蛋白毒素制造技术

来自致病杆菌属的蛋白与昆虫接触时对其有毒性。这些蛋白毒素可施用于昆虫幼虫食物和植物以控制昆虫。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利申请要求出自美国临时专利申请序号60/045,641(1997年5月5日提交)的优先权。专利
本专利技术涉及从细菌中分离的毒素及其该毒素作为杀昆虫剂的应用。专利技术背景过去，一直对用生物制剂作为控制害虫的一种选择感兴趣。得到开发的一种这样的方法是使用某些线虫属控制昆虫的潜力。诸如Steinernema和Heterorhabditis属的线虫可用做生物制剂的部分原因是它们分别可转播致病杆菌属和光杆状菌属的杀昆虫细菌共生体。一旦进入昆虫体内，这些线虫将它们的细菌共生体释放至昆虫血淋巴中，这些细菌在昆虫血淋巴中繁殖并最终导致昆虫死亡。然后线虫在昆虫尸体内发育和繁殖。含有细菌的线虫后代作为侵染性幼虫离开昆虫尸体，然后它可以侵入其它的幼虫，从而重复导致线虫繁殖的循环。尽管此循环易于微量操作，但是为了有效地作为广泛使用的杀昆虫剂，需要在实验室条件下向大规模进行此循环转变，这是非常困难和昂贵的，并且不能有效地生产、维持、分装和应用。除了诸如线虫的控制害虫的生物方法，目前还有一些天然来源的可商业购买的杀虫控制试剂。这些天然来源方法与化学合成方法同样有效。这样的天然存在的试剂之一是从细菌苏云金芽孢杆菌(Bt)得到的晶体蛋白毒素。这些蛋白毒素已配制成可喷洒的昆虫控制试剂。Bt技术更近期的应用已将合成毒素的基因分离并转入植物中。随后转基因植物合成Bt毒素，由此控制昆虫(见美国专利号5,380,831、5,567,600和5,567,862，授予Mycogen，San Diego，CA)。转Bt基因植物十分有效并且预计将在某些作物和地区中大量使用。这种方法引起了一种关注，即比传统的喷洒施用更快产生的抗性控制问题。因此，非常需要开发其它与Bt不同的合成毒素的细菌来源，这种细菌来源可用于转基因植物策略，或与Bt结合用于产生控制昆虫的转基因植物。现有技术已知，致病杆菌属与Stenernema属线虫共生。不利地是，如在许多文章中所报道的，此细菌只有在注射入昆虫幼虫体内时才有杀昆虫活性，而在经口摄入时不表现生物活性。因为上述原因，难以有效地利用线虫或其细菌共生体的杀昆虫特性。因此，很有必要发掘来自致病杆菌属细菌的具有经口摄入活性的蛋白试剂，以便能将由此得到的产物配制成可喷洒的杀昆虫剂或者分离编码该蛋白试剂的细菌基因以用于产生转基因植物。在申请人的专利技术之前，还没有可合成确定具有经口摄入活性的蛋白毒素的已知致病杆菌属菌种或菌株。专利技术概述由致病杆菌属正在生长的细菌细胞合成和分泌的天然毒素是蛋白复合物。此蛋白复合物具有从约800到约3300KDa之间变动的天然分子大小，经SDA-PAGE凝胶分析可分成很多蛋白组分。该毒素一旦与昆虫接触，表现出针对多种昆虫的明显毒性。而且，通过改变培养基条件可改进毒素活性。另外，该毒素具有蛋白的特性，其特征在于其活性是热不稳定性的并且对蛋白水解敏感。本专利技术提供了易于施用的杀昆虫蛋白。本专利技术也提供了施用杀昆虫毒素的方法，所述毒素具有功能性活性并有效地抵抗多种目的昆虫。通过下面的说明，本专利技术的目的、优点及特征将变得更加清楚。附图简述附图说明图1是通过使用一套特定引物的rep-PCR确定的致病杆菌属菌株的亲缘关系图。图1上方的轴线是根据rep-PCR产物记录测量的菌株间相似百分数。在右边的轴线上，数字和字母表示所测的各种菌株。分离的水平平线之间的垂直线表示以水平线上表示的菌株或菌株群(例如菌种DEX1与菌种X.nem有约83％的相似性)之间的相关程度(从垂直线与上方轴线的外推交叉点读出)。专利技术详述本专利技术涉及由致病杆菌属细菌合成的独特杀昆虫蛋白毒素种类的开发，该毒素如此处所述的具有经口摄入的抵抗昆虫的功能性活性。致病杆菌属菌种/菌株可从各种来源分离。这样的来源之一是昆虫致病线虫，更具体地Steinernema属线虫或由这些线虫侵染的昆虫尸体。也可能是可以容纳合成杀昆虫毒素的致病杆菌属细菌的其它来源。所述毒素具有如此处定义的功能性活性。在自然环境中这样的来源可以是陆生的或水生的。致病杆菌属在分类学上为肠杆菌科的成员，尽管它有某些非此科典型特征的特征。例如，该属的菌株是典型的硝酸盐还原阴性和过氧化氢酶阴性。约三年前，致病杆菌属又分出第二个属；即只含一种发光光杆状菌(以前称发光致病杆菌)的光杆状菌属(Boemare等，1993，国际系统细菌学杂志，43，249-255)。这种区别是基于几个容易由熟练技术人员鉴定的不同特征。这些不同包括DNA-DNA杂交研究结果；过氧化氢酶表型存在(光杆状菌属)或缺失(致病杆菌属)；生物发光现象的存在(光杆状菌属)或缺失(致病杆菌属)；线虫宿主的家族，其中致病杆菌属在Steinernematidae科中发现而光杆状菌属在Heterorhabditidae科中专利技术；以及细胞脂肪酸的比较分析(Janse等，1990，应用微生物学通讯，10，131-135；Suzuki等，1990，普通应用微生物杂志，36，393-401)。另外，最近集中于16s rRNA基因的序列(Rainey等，1995，国际系统细菌学杂志，45，379-381)和限制性分析(Brunel，等，1997，应用环境微生物学，63，574-580)的分子研究也支持这两个属的分开。这种命名法的改变包括在本说明书中，将来命名法的改变不应改变此处所述的本专利技术的范围。为了确定此处公开的菌株是致病杆菌属菌株，这些菌株通过定义致病杆菌属菌种/菌株并将它们与其它肠杆菌科和光状杆菌属菌种/菌株区分开的识别特征来鉴定(Farmer，1984，Bergey系统细菌学手册，第1卷，第510-511页，Akhurst和Boemare，1988，普通微生物学杂志，134，第1835-1845页，Boemare等，1993，国际系统细菌学杂志，43，第249-255页；此处引用作为参考)。致病杆菌属的特征如下革兰氏染色阴性杆菌，微生物大小0.3-2×2-10μm，白色-黄色/褐色菌落的色素形成，包涵体的存在，过氧化氢酶的缺失，不能还原硝酸盐，没有生物发光现象，从培养基摄入染料的能力，白明胶水解阳性，能够在肠杆菌科选择培养基上生长，生长温度低于37℃，厌氧条件下存活，和移动性。目前，细菌致病杆菌属包括4种确认的种，嗜线虫致病杆菌、波氏致病杆菌、伯氏致病杆菌及贝氏致病杆菌(Brunel等，1997，应用环境微生物学，63，574-580)。文献中已描述一系列的相关菌株(例如Akhurst和Boemare，1988，普通微生物学杂志，134，1835-1845；Boemare等，1993，国际系统细菌学杂志，43，第249-255页，Putz等，1990，应用环境微生物学，56，181-186；Brunel等，1997，应用环境微生物学，63，574-580，Rainey等，1995，国际系统细菌学杂志，45，379-381)。此处已有多种致病杆菌属菌株得到鉴定。这些菌株及其特征列于实施例的表1中。这些菌株已保藏于农业研究机构保藏中心(NRRL)，地址为1815 North UnivesityStreet Peoria，Illinosi 61604，美国。如从图1可看到的，这些菌株是不同的。可以预见，将来可能有其它的致病杆菌属种类，它们将具有所述菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，已含有效剂量的具抵抗昆虫的功能性活性的致病杆菌蛋白毒素，所述蛋白毒素来自天然分子大小至少１００ＫＤａ的蛋白。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：JC安西根，DJ伯温，JL坦纳，TA希驰，JK帕泰尔，JA斯特里克兰德，GL欧尔，RO法提格，SB宾特里姆，RT弗兰驰康斯坦特，
申请(专利权)人：道农业科学公司，威斯康星阿路姆尼研究基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]