新的来自嗜线虫致病杆菌的杀虫毒素以及编码此毒素的核酸序列制造技术

本发明专利技术公开了分离自嗜线虫致病杆菌，波氏致病杆菌以及发光光杆状菌的新的核酸序列，其表达产生新的杀虫毒素。本发明专利技术进一步公开了含有能够防治害虫的杀虫毒素的组合物和制剂。本发明专利技术进一步描述了生产该毒素的方法以及该核苷酸序列的使用的方法，例如在微生物中防治害虫或在转基因植物中赋予昆虫抗性的方法。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及来自嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophilus)、波氏致病杆菌(Xenorhabdus poinarii)以及发光光杆状菌(Photorhabdus luminescens)的新的毒素，其表达产生所述毒素的核酸序列，以及产生和使用毒素以及相应的核酸序列防治昆虫的方法。害虫是农作物减产的主要原因。仅在美国每年由各种害虫引起的损失大约为77亿美元。除了农作物遭受的损失外，害虫也是菜农、果农以及花农的一个负担，并且它们也是花匠和家庭业主所讨厌的东西。害虫主要通过化学杀虫剂的高强度应用被防治，化学杀虫剂通过抑制昆虫生长，阻止昆虫进食或繁殖，或杀死昆虫来起作用。好的昆虫防治因此可以被获得，但是这些化学制剂有时也影响其它有益的昆虫。化学杀虫剂的广泛应用产生的另一个问题是抗性昆虫变种的出现。不同的抗性管理策略可部分缓和这种现象，但是可供选择的害虫防治剂的需求仍呈现上升的势头，生物害虫防治剂，例如苏云金牙孢杆菌表达的杀虫毒素如δ-内毒素，在应用方面产生了令人满意的结果，提供了对化学杀虫剂的替代或补充。最近，编码这些δ-内毒素的基因被分离出来并且它们在异源宿主中的表达显示出其提供了另一种防治经济重要害虫的工具。特别地，杀虫毒素在转基因植物中的表达，例如苏云金牙孢杆菌δ-内毒素，提供了有效的抗选择害虫的保护，并且表达这些毒素的转基因植物已被商品化，允许农民减少化学杀虫剂的应用。然而，即使在这种情况下，抗性仍存在一种发展的可能，并且仅有一小部分的特定的害虫是可防治的。所以，长期期望但是仍没有满足的需要是新的且能有效的给农民带来经济利益以及环保上可接受的昆虫防治剂。本专利技术满足了长期存在的对新昆虫防治剂的需求。特别是针对经济重要害虫以及有效控制对已存在的昆虫防治剂有抗性的害虫的防治剂的需求。此外，将对环境的负担减少到最小的杀虫剂是所期望的。在新的昆虫防治剂的研究中，对来自Heterorhabdus与Steinemema属的线虫的一定的种特别感兴趣，因为它们的杀虫特性。它们杀死昆虫的幼虫及其用死幼虫作为食物的后代。实际上，它们的杀虫活性取决于生活在线虫中的共生细菌。这些共生细菌为Heterorhabdus情况下的光杆状菌属以及Steinernema情况下的致病杆菌属。本专利技术涉及分离自嗜线虫致病杆菌的核苷酸序列，以及与其基本上相似的核苷酸序列，它们的表达产生了对经济重要害虫特别是植物害虫有较高毒性的杀虫毒素。本专利技术进一步提供了来自于该核苷酸序列表达产生的杀虫毒素，以及含有能够抑制害虫生存能力，生长或繁殖，或降低农作物的与害虫相关的损失的组合物和制剂。本专利技术进一步提供了一种生产毒素的方法以及利用核苷酸例如在微生物中防治害虫或在转基因植物中赋予害虫抗性的方法，以及使用毒素与含有毒素的组合物和制剂的方法例如应用该毒素，组合物和制剂到昆虫感染区或者预防处理昆虫易感区或以植物对赋予保护或对害虫的抗性。新的毒素对小菜蛾(Plutella xylostella)(菱形斑纹蛾(diamonback moth))具有非常高的杀虫作用，小菜蛾是经济上重要的害虫。毒素可被用于多种昆虫防治的策略，产生对环境有最小影响的最大效率。一方面，本专利技术提供了一种分离的核苷酸分子，包括(a)一个基本上相似于选自含有下述序列的组的核苷酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,以及SEQ ID NO:14；或(b)一个与(a)的核苷酸序列同类编码的核苷酸序列；其中所述核酸分子的表达产生至少一种有抗害虫活性的毒素。在此方面的一个实施方案中，核苷酸序列与基本上相似于SEQ IDNO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,以及SEQ ID NO:14的核苷酸同类编码。优选的核苷酸序列基本上相似于SEQ ID NO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,以及SEQ ID NO:14的核苷酸。更优选的核苷酸序列编码选自含有SEQID NO:2,3,5,7,9,11,13,以及15的氨基酸序列。最优选的，核苷酸序列含有SEQ ID NO:1核苷酸的569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:12,或SEQ ID NO:14。在另一个实施方案中，核苷酸序列含有包含在pClB9369(NRRL B-21883)中的大约3.0 kb DNA片段。根据一个优选的实施方案，来自本专利技术核苷酸分子的表达的毒素具有抗小菜蛾的活性。另一方面，本专利技术提供了一个分离的核酸分子，其含有一个20,25,30,35,40,45,或50(优选的20)碱基对核苷酸部分在序列上等同于选自含有下述序列的组的核苷酸序列的分别连续的20,25,30,35,40,45,或50(优选的20)碱基对核苷酸部分SEQ ID NO:1的569-979核苷酸SEQ ID NO:1的1045-2334核苷酸，SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,和SEQ ID NO:14，其中上述核酸分子表达产生至少一种有抗害虫活性的毒素。本专利技术也提供了一个嵌合基因，其包括有效的连接于本专利技术的核酸分子的异源启动子序列。另外，本专利技术提供了含有此嵌合基因的重组载体。进一步，本专利技术提供了一个含有该嵌合基因的宿主细胞。根据本专利技术的这个方面，宿主细胞可以是一个细菌细胞，一个酵母细胞，或者一个植物细胞，优选的是植物细胞。更进一步，本专利技术提供了含有这个植物细胞的植物。优选的植物为玉米。在另一方面，本专利技术提供了由本专利技术DNA分子表达产生的毒素。根据优选的实施方案，本专利技术的毒素具有抗小菜蛾的活性。在一个实施方案中，毒素由命名为NRRL保藏号为B-21883的大肠杆菌(E.coli)菌株产生。在另一个实施方案中，本专利技术的毒素含有选自包括SEQ ID NO:2,3,5,7,9,11,13,以及15的组的氨基酸序列。本专利技术也提供了一种组合物，其含有杀虫有效量的本专利技术的毒素。在另一方面，本专利技术提供了一种产生有抗昆虫活性的毒素的方法，包括(a)获得含有一个嵌合基因的宿主细胞，嵌合基因本身含有一段与本专利技术的核酸分子有效连接的异源启动子序列；以及(b)核酸分子在细胞中表达，其产生至少一种有效抗昆虫的毒素。进一步，本专利技术提供一种产生抗昆虫植物的方法，包括导入本专利技术的核酸分子到植物中，其中的核酸分子在植物中以对防治昆虫的有效量进行表达。根据优选的实施方案，昆虫为小菜蛾。进一步的，本专利技术提供了一种防治昆虫本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，包括：（ａ） 一种基本上相似于选自下列的核苷酸序列的核苷酸序列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的核苷酸５６９－９７９，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的核苷酸１０４５－２３３４，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２，以及ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４；或（ｂ） 与（ａ）的核苷酸序列同类编码的核苷酸序列；其中所述核酸分子的表达产生至少一种有抗昆虫活性的毒素。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：VC卡拉默，MK摩根，AR安德森，
申请(专利权)人：辛根塔参与股份公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]