来自伯氏致病杆菌的毒素复合物蛋白和基因制造技术

本发明专利技术涉及新的致病杆菌毒素复合物（ＴＣ）蛋白和编码这些蛋白质的基因。更具体的，本发明专利技术涉及得自伯氏致病杆菌ＩＬＭ１０４菌株的ＴＣ基因和蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
昆虫和其他害虫引起的作物损失和控制这些害虫的花费使农民每年损失数十亿美元。由虫害引起的损失在农业生产领域包括作物产量下降、作物质量降低和收获成本提高。虫害对于蔬菜和水果种植者、观赏花卉生产者和家庭园丁和户主也是一种负担。栽培方法(如轮作和使用高水平的氮肥)部分减轻了由农业害虫引起的问题。然而，农田利用的多种需要限制了轮作的使用。此外，一些昆虫的越冬性特征在一些地区破坏了轮作。因此，有效水平的控制最依赖合成化学杀虫剂。然而，使用合成化学杀虫剂具有若干缺点。例如，使用这些化学品可能对许多益虫产生不利影响。靶昆虫也已发展出了对一些化学杀虫剂的抗性。另外，雨和杀虫剂使用装置校准不正确可能导致很差的控制。使用杀虫剂经常引起环境问题，如不正确使用时的土壤和供水污染，残留物还可能残留于经处理的水果和蔬菜中。操作一些杀虫剂还可能对使用者造成危害。对使用杀虫剂的新的严格限制和一些有效杀虫剂的消失可能限制了对控制具有破坏性且代价高昂的害虫的有效选择。用生物杀虫剂取代合成化学杀虫剂或这些物质的组合可以降低环境中有毒化学品的水平。现在成功使用的一些生物杀虫剂来自土壤微生物苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，(B.t.))。大多数B.t.菌株不表现杀虫活性，但一些B.t.菌株产生对害虫(如昆虫)具有高毒性并且其毒活性具有特异性的蛋白质。已经分离了编码δ-内毒素蛋白的基因。其他芽孢杆菌物种也产生杀虫蛋白质。Hofte和Whiteley将B.t.晶体蛋白分为四个大类(Hofte，H.，H.R.Whiteley Mcirobiological Reviews 52(2)242-255)。这些类别为CryI(鳞翅目特异性)、CryII(鳞翅目和双翅目特异性)、CryIII(鞘翅目特异性)和CryIV(双翅目特异性)。也已报道发现了对其他害虫具有特异毒性的菌株。例如，已经提出以CryV和CryVI命名一类线虫特异性的毒素基因。Hofte和Whiteley于1989年对晶体蛋白的命名和分类方案是基于推定的氨基酸序列和毒素的活性谱。该系统适于覆盖分为五个主要类别的14种不同类型的毒素基因。随着越来越多的编码具有多种杀虫活性谱的基因被发现，1989年的命名方案已变得难以实行。因此，采用了修订的命名方案，该命名方案只基于氨基酸同一性(Crickmore等1998，Microbiology andMolecular Biology Reviews 62807-813)。已经产生并批准使用了基于重组DNA的B.t.产物。另外，使用遗传工程技术完善了多种将这些毒素递送到农业环境的方法。它们包括使用用毒素基因遗传改造以获得昆虫抗性的植物和使用稳定的完整微生物细胞作为毒素递送载体。因此，分离的芽孢杆菌毒素开始具有商业价值。最初将B.t.蛋白毒素配制成可喷雾的昆虫控制剂。B.t.技术相对较新的应用是分离编码这些毒素的基因并转化植物。接着转基因植物产生毒素，从而提供昆虫控制。参阅Mycogen Corporation的U.S.专利No.5,380,831、5,567,600、5,567,862。转基因B.t.植物相当高效，预测在一些作物和地区中可得到高度应用。农业上成功的使用芽孢杆菌(及其他生物)杀虫蛋白还存在一些障碍。某些昆虫可以耐受芽孢杆菌毒素的效力。现已证明如棉子象鼻虫、切根虫和美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)等昆虫以及多数物种的成虫对许多B.t.δ-内毒素不具有显著的敏感性。另一个潜在的障碍是昆虫发展出对B.t.毒素的抗性。B.t.植物广泛应用的可能已经引起一些担忧，即可能比传统的喷雾应用更快的出现抗性治理问题。尽管在实验室中已经选择了大量昆虫对B.t.毒素的抗性，但只有菱形斑蛾(Plutella xylostella)已证明在大田环境中具有抗性(Ferre，J.和Van Rie，J.，Annu.Rev.Entomol.47501-533，2002)。B.t.转基因植物技术中的抗性治理策略已经引起巨大的关注。已经提出了若干策略来保持有效使用苏云金芽孢杆菌毒素的能力。这些策略包括如带有保护区(refuge)的高剂量、(如天然细菌中)交替使用或共同使用不同的毒素(McGaughey等(1998)，″B.t.Resistance Management，″NatureBiotechnol.16144-146)。因此，仍然非常需要发展可以在植物中表达以有效控制多种昆虫的其他基因。除了继续尝试发现新的B.t.毒素以外(由于已经发现了大量B.t.毒素而变得越来越困难)，还非常需要发现产生可用于转基因植物策略的毒素的(不同于B.t.的)其他细菌来源。最近从光杆状菌(Photorhabdus)/致病杆菌(Xenorhabdus)组细菌中克隆杀虫毒素基因的尝试提出了苏云金芽孢杆菌毒素的潜在替代物。致病杆菌属分类学定义为肠杆菌科成员，尽管其具有该科的某些非典型特征。例如，该属菌株一般为硝酸盐还原阴性和过氧化氢酶阴性。最近刚刚将致病杆菌细分产生第二个属——光杆状菌，其含有三个物种，光杆状菌asymbiotica、光杆状菌temperata和发光光杆状菌(P.luminescens)。发光光杆状菌有三个公认的亚种，发光光杆状菌akhurstii亚种、发光光杆状菌laumondii亚种和发光光杆状菌luminescens亚种(典型种)。(Fischer-LeSaux，M.，Viallard，V.，Brunel，B.，Normand，P.，Boemare，N.E.TitlePolyphasic classification of the genus Photorhabdus and proposal of newtaxaP.luminescens subsp.luminescens subsp.nov.，P.luminescens subsp.akhurstii subsp.nov.，P.luminescens subsp.laumondii subsp.nov.，P.temperata sp.nov.，P.temperata subsp.temperata subsp.nov.and P.asymbiotica sp.nov.Int.J.Syst.Bacteriol.49；1645-1656，(1999))。这一区分基于本领域技术人员容易鉴定的若干区别特征。这些区别包括DNA-DNA表征研究、过氧化氢酶活性表型存在(光杆状菌)或不存在(致病杆菌)、生物发光存在(光杆状菌)或不存在(致病杆菌)、宿主线虫的科(致病杆菌发现于斯氏线虫(Steinernematidae)而光杆状菌发现于异小杆线虫(Heterorhabditidae))以及胞内脂肪酸比较分析(Janse等1990，Lett.Appl.Microbiol.10，131-135、Suzuki等1990，J.Gen.Appl.Microbiol.，36，393-401)。另外，最近着眼于16S rRNA基因的序列(Rainey等，1995，Int.J.Syst.Bacteril.，45，379-381)和限制性(Brunel等，1997，App.Environ.本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有针对害虫的毒素活性的分离蛋白质，其中编码所述蛋白质的核酸分子与选自ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：３和ＳＥＱＩＤＮＯ：５的核酸探针的完全互补物在严格条件下杂交。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：PC阿沛比克侯德，TD海伊，JJ希茨，T米德，ZS李，JM里拉，SM拉塞尔，RL汤普森，JC米切尔，K芬斯尔，
申请(专利权)人：美国陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]