本发明专利技术公开了从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定获得季也蒙有孢汗逊酵母菌株的方法。即包括红葡萄生产原料及窖泥进行纯化分离，及按照WL营养琼脂培养基形态学鉴定法结合《微生物分类学》的方法进行菌种鉴定2个步骤，最终得到纯化的季也蒙有孢汗逊酵母菌株。从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定获得季也蒙有孢汗逊酵母菌株的方法，有利于用纯菌株培养出具有独特愉快香气风格的红葡萄酒。并且，这种从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定获得季也蒙有孢汗逊酵母菌株的方法具有无杂菌污染、菌种易保藏、操作快速简便、产品质量稳定的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种从红葡萄酒生产原料及窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法。
技术介绍
非酿酒酵母常常是葡萄酒非接种发酵的主要参与菌群，它们的代谢与发酵作用深刻地影响着葡萄酒的成分和风味品质，在一定程度上能够提高葡萄酒产品风味的复杂性，它不仅能够代谢葡萄汁中的糖生成甘油、高级醇、各种挥发性化合物，还能够产生多种胞外酶影响葡萄酒的结构与风味品质。Moreria等(2005)对葡萄汁有孢汉逊酵母0 wra/ ),季也蒙有孢汉逊酵母 (.H. guiIliermondiI)和酿酒酵母(5 cere visiae)的纯种发酵及混合发酵进行了研究，发现三种菌株都具有相似乙醇产量和生产率，在混合发酵时，葡萄汁有孢汗生酵母0 wra/ )和酿酒酵母(5 ce/wisiae)皆会受季也蒙有孢汗逊酵母的影响，生长率降低。而季也蒙有孢汉逊酵母iH. guiIliermondii )具有最高的生长力，同时也是最佳的2-乙酸苯乙酯和2-苯基乙醇的产生者，并且不受其它菌的影响，而这些物质可赋于葡萄酒果香与花香。在纯种发酵中，葡萄汁有孢汗生酵母0 生成最高量的含重硫化合物，季也蒙有孢汗逊酵母iH. guiIliermondii)和酿酒酵母(51 cerevisiae)产生相似量的甲硫醇和2-甲基四氢噻吩-3-酮。但季也蒙有孢汗逊酵母0 gui I Iiermondii )能生相对成较高量的3_甲硫基丙酸，3_甲硫基乙酸丙酷。传统的分类鉴定主要根据《酵母菌的分类研究学》(Kreger-van Ri j，1998)第四版和Barnett等(2000)编著的《酵母菌特征与鉴定》第三版的标准为依据。在对酵母进行鉴定前，须在形态学和生理学方面获得大量的鉴定特征。WL(ffallerstein Laboratory Nutrient Agar)培养基鉴定方法相对于酵母菌的常规鉴定是一种新兴的、较快的鉴定方法。大量研究表明葡萄酒自然发酵过程中出现的大多数典型酵母菌都可以基于其在WL培养基上生长所形成的菌落颜色及形态进行归类和区别，并对不同葡萄酒酵母在WL培养基上的菌落特征进行了详细的描述。特别是对于季也蒙有孢汗逊酵母的鉴定，在颜色形态方面有着相当详细具体的描述，具有很好的鉴别能力，可以避免生理生化分析的大量工作，对于酵母菌鉴定工作来说，是相当简便、快速并且十分有效和节俭的方法，由于WL培养基对菌种的生理状态依赖程度很大，菌种处于不同的生理状态可能会导致不同的培养结果，尤其是菌落的颜色。所以本试验作出相应的改进。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为了解决上述的季也蒙有孢汗逊酵母菌在WL培养基上可能会出现不同的培养结果，而导致鉴定结果失败的现象，提供一种改进后的WL培养基即WL营养琼脂培养基分离纯化鉴定红葡萄酒生产原料或窖泥中季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法。本专利技术的技术方案 一种从红葡萄酒生产原料及窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法，包括下述工艺步骤 (1)、从张裕红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌 ①、在无菌条件下，取张裕红葡萄酒生产原料或窖泥8 15g，加入5(Tl50mL浓度为O.9%的无菌生理盐水，浸泡15 25min后摇匀，用移液枪吸取O. 05mL O. 2mL菌液，采用浓度为O. 9%的生理盐水分别进行15 25倍、9(Γ120倍、900 1200倍的梯度稀释，得三份待分离的稀释菌液； ②、在超净工作台上，取融化后并降温至约45飞5°C的YPD固体培养基倒平板，每个平 板中注入约15 25mL，按平板中所加入的融化后并降温至约45飞5°C的YPD固体培养基的量计算，即每升融化后并降温至约45飞5°C的YPD固体培养基加入O. I IOOmg的抑制细菌的抗生素，待融化后并降温至约45飞5°C的YPD固体培养基凝固后，取①所得的三份待分离的稀释菌液O. 05mL O. 2mL分别加入到平板上，用无菌的三角刮铲将菌液均匀涂布于平板表面； 所述的YPD固体培养基配方糖12 20g，多价蛋白酵母膏5 10g，蛋白胨12 20g，琼脂12 20g，水IOOOmL ;其中所述的糖为白糖、红糖、蔗糖、冰糖、葡萄糖或蜂蜜中的一种或两种以上组成的混合物； 所述的抑制细囷的抗生素为青霉素、链霉素、氣霉素、红霉素或庆大霉素； ③、将步骤②制备好的平板置于25°C 30°C的培养箱中培养3 5天； ④、用接种环分别挑取每个平板上出现的10-30个形态具有区别的典型酵母菌菌落至另一空白的YPD固体培养基平板划线，将平板置于25°C 30°C的培养箱中培养3 5天； ⑤、重复步骤④直至菌落完全纯化，纯化菌株斜面保藏于4°C冰箱中备用； (2)、将步骤(I)分离纯化获得的多个纯的酵母菌菌株每株分别划线接种于YPD固体培养基、YPD液体培养基和空白的WL营养琼脂培养基平板上，27 30°C下分别培养5-7天后，按照WL营养琼脂培养基形态学鉴定法结合《微生物分类学》的方法进行菌种鉴定，经鉴定最终获得季也蒙有孢汉逊酵母菌； 其中所述的YPD固体培养基配方糖12 20g，多价蛋白酵母膏5 10g，蛋白胨12 20g，琼脂12 20g，水IOOOmL ;其中所述的糖为白糖、红糖、蔗糖、冰糖、葡萄糖或蜂蜜中的一种或两种以上组成的混合物； 所述的YPD液体培养基配方，以每升计算，酵母浸粉lg、葡萄糖2g、蛋白胨2g、琼脂2g，余量以水补足； 所述的WL营养琼脂培养基，以每升计算，含有5. Og酵母浸粉、5. Og酸水解酪蛋白、50g葡萄糖、O. 55g磷酸氢二钾、O. 425g氯化钾、O. 125g氯化钙、O. 125g硫酸镁、O. 022溴甲酚绿、17. Og琼脂，余量由去离子水补足。配制好的WL培养基，调节pH值为6.0，在120°C下灭菌20分钟。同时利用上述的从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法还可同时获得葡萄汁有孢汉逊酵母菌、酿酒酵母菌和红酵母菌。季也蒙有孢汗逊酵母菌、葡萄汁有孢汉逊酵母菌、酿酒酵母菌和红酵母菌，这4种酵母菌都是在葡萄酒中发现的，但在张裕红葡萄酒的生产原料或窖泥中，对这些酵母菌的分离和纯化是为了找出其中的各种菌与葡萄酒风味产生之间的直接关系。 上述最终所得的季也蒙有孢汗逊酵母菌iHanseniaspora guiIliermondii),其生长特征在于在YPD固体培养基上3-5天菌落较大，圆形，乳白色凸起，边缘整齐，易挑起；在YPD液体培养基生长有沉淀。在WL营养琼脂培养基5-7天菌落中央深绿色泛白，四周浅黄色，菌落扁平，边缘有透明环。本专利技术的有益效果 本专利技术的从红葡萄酒生产原料及窖泥中分离纯化季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法，由于采用WL营养琼脂培养基并结合微生物学技术从红葡萄酒生产原料及窖泥中分离纯化出季也蒙有孢汗逊酵母菌菌株，以利于用纯菌株培养出具有独特愉快香气风格的红葡萄酒。进一步，本专利技术的从红葡萄酒生产原料及窖泥中分离纯化季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法，具有无杂菌污染、菌种易保藏、操作快速简便、产品质量稳定的特点。·具体实施例方式下面通过具体实施例对本专利技术进一步阐述，但并不限制本专利技术。本专利技术所用的红葡萄酒生产原料或窖泥取自山东烟台张裕卡斯特酒庄。本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化鉴定季也蒙有孢汗逊酵母菌的方法，其特征在于包括如下步骤：首先，利用YPD固体培养基从红葡萄酒生产原料或窖泥中分离纯化季也蒙有孢汗逊酵母菌；所述的YPD固体培养基配方：糖12～20g，多价蛋白酵母膏5～10g，蛋白胨12～20g，琼脂12～20g，水1000mL；然后，将分离纯化获得的酵母菌菌株分别划线接种于空白的WL营养琼脂培养基平板上，27~30℃培养5？7天后，按照WL营养琼脂培养基形态学鉴定法结合《微生物分类学》的方法进行菌种鉴定，最终获得季也蒙有孢汉逊酵母菌；其中所述的WL营养琼脂培养基，以每升计算，含有4.5~5.5g酵母浸粉、4.5~5.5g酸水解酪蛋白、45~55g葡萄糖、0.45~0.65g磷酸氢二钾、0.325~0.525g氯化钾、0.10~0.15g氯化钙、0.10~0.15g硫酸镁、0.020~0.024g溴甲酚绿、15~19g琼脂,余量由去离子水补足。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冯涛，游雪燕，庄海宁，荣志伟，周彬耀，
申请(专利权)人：上海应用技术学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。