本发明专利技术公开了一种绵玉米淹水胁迫响应zmERF2基因启动子的克隆及其应用，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，该启动子含有1个ARE、1个GARE、1个GC?motif、2个Skn-1motif、1个CGTCA-motif和1个MBS位点顺式元件，这些顺式元件与植物激素、厌氧胁迫响应相关；是一个组织特异型的启动子，只在根系中表达；是一个诱导型的启动子，受淹水诱导高效表达。该启动子与抗虫、抗病、抗逆等目的基因连接，在淹水、涝渍条件下，可提高转基因植株根部的抗虫、抗病、抗逆境能力。同时该启动子只在根部表达，不涉及食用转基因植物地上部分的食品安全问题。zmERF2启动子在旱生植物的耐渍遗传改良中，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程
，涉及一种绵玉米淹水胁迫响应zmERF2基因启动子的克隆及其应用。
技术介绍
我国每年受洪涝灾害的农田面积平均为956万公顷，其中严重的年份，受灾面积达1500万公顷以上。在亚洲地区，洪涝灾害给玉米的生产造成了很大的损失，仅南亚，每年超过15%的玉米种植面积遭受不同程度的危害。在印度，洪涝灾害造成玉米每年减产25-30%。我国南方春玉米和北方夏玉米在正常的栽培季节中，经常遭受洪涝和溃害，玉米根系长期处于低氧状态，导致玉米减产10% -40%。涝溃害已成为我国南方玉米高产、稳产的主要制约因子之一。因此，克隆玉米淹水胁迫响应基因及其启动子，对阐明玉米淹水胁迫 响应形成的分子机理以及玉米和其他旱生作物耐涝溃的遗传改良，具有十分重要的理论价值和实践意义。ERF基因是参与植物非生物胁迫响应的关键基因之一，是水稻、深水稻和拟南芥淹水胁迫响应的关键基因。因此，克隆玉米ERF基因的启动子，有助于阐明玉米耐溃性形成的分子机制，同时为玉米及其他旱生作物的耐溃遗传改良提供理论指导。然而，玉米ERF启动子的克隆，目前，尚未见有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种绵玉米淹水胁迫响应zmERF2基因启动子的克隆及其应用，含有 I 个 ARE、I 个 GAREU 个 GC motif、2 个 Skn-ImotifU 个 CGTCAiotif 和 I 个MBS位点顺式元件，这些顺式元件与植物激素、厌氧胁迫响应相关；是一个组织特异型的启动子，只在根系中表达；是一个诱导型的启动子，受淹水诱导高效表达。该启动子与抗虫、抗病、抗逆等目的基因连接，在淹水、涝溃条件下，可提高转基因植株根部的抗虫、抗病、抗逆境能力。同时该启动子只在根部表达，不涉及食用转基因植物地上部分的食品安全问题。zmERF2启动子在旱生植物的耐溃遗传改良中，具有很好的应用前景。其技术方案如下I、玉米zmERF2基因的获得根据已知的玉米基因组信息，使用烟草ERF2蛋白的AP2/ERF结构域高度保守的蛋白质序列，进行同源比对分析，电子克隆出121个ERF基因。通过与拟南芥、水稻、烟草等其他植物ERF基因的比较分析，剔除48个假阳性，获得了 73个ERF基因，分别命名为zmERFl—zmERF73。玉米自交系Hz32的耐溃性较强，而Mol7耐溃性较弱，在玉米3叶I心期，分别对Hz32和Mol7进行0、4、12h的淹水处理，并利用real-time PCR对73个ERF基因在各处理根系的表达进行了分析，结果发现zmERF2基因在Hz32根系受淹水诱导高效表达，而在Mol7中表达量低，结果暗示zmERF2基因的启动子是淹水胁迫响应的诱导型启动子。2、玉米自交系Hz32叶片总DNA的提取取玉米叶片5. Og于液氮中研磨,转入50ml离心管中。加预热至95°C的CTAB缓冲液(I. 17MNaCL、0. 0016M EDTA-8. 0,0. 835M Ttis-7. 5,1. 6% CTAB, 1% β-疏基乙醇)10ml，混匀。在65°C水浴锅内反应90分钟，不时轻摇离心管。取出离心管，待冷至室温后，加入等体积氯仿异醇(24 I)，小心摇动试管10分钟。8000rpm离心10分钟，将上清转至另一50ml离心管中。加2/3体积异丙醇，小心混匀，将棉絮状DNA转入盛10ml70%乙醇的50ml离心管中，浸泡12小时。倒掉70%乙醇，将DNA晾干，加入Iml TE溶解。待DNA完全溶解后,转入2. Oml离心管中，加入10 μ 110mg/ml RNaseA,混勻；在37°C下,温育2小时。再用Iml苯酚氯仿异戊醇(25 24 I)抽提一次，8000rpm离心10分钟。将上清液转入2. Oml离心管中，加入1/10体积的3M NaAC (PH5. 2)，2/3体积异丙醇沉淀DNA0将棉絮状DNA转入2. Oml离心管中，用70%乙醇洗涤一次，短暂离心，使DNA贴壁，倒去70%乙醇，晾干DNA。待DNA晾干后，加入0.5ml T. E溶液，完全溶解DNA，于_20°C长期保存。3、zmERF2基因启动子的克隆根据玉米自交系B73zmERF2基因的启动子序列，设计一对特异引物，左引物5-' ATGGTCGGTGCCTGCTGCGTGGG-3’，右引物5' -GCACAAATCCTTTCCCTTTCCTT-3'。以 Hz32的DNA作为模板，进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为2. 5 μ 110XPCR缓冲液，2 μ IlOmM·dNTPs，I μ IlOmM特异引物，I μ IlOmM特异右引物，I单位Taq酶，40ng模板DNA，总体积25 μ I。PCR扩增程序为95°C 3分钟；95°C I分钟，61°C I分钟，72°C 2分钟30秒，循环35次；72°C 7分钟；4°C 30分钟。PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中120伏直流电压电泳45分钟，使用北京全式金生物技术有限公司的凝胶回收试剂盒，回收特异DNA片段，并将该DNA片段连接到PGEM-T easy载体上，进行DNA测序。4、转化载体的构建使用带酶切位点的引物(左引物加HindIII酶切位点，右引物加BamHI酶切位点)，以玉米自交系Hz32的DNA为模板进行PCR扩增。将PCR产物与pGEM_T easy载体连接，转化Escherichia coli DH5 α，生长在含氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体平板上的白色菌株被分离出来。经PCR检测，选择阳性克隆进行DNA测序，提取所克隆zmERF2启动子序列正确的质粒DNA。使用HindIII和BamHI限制性内切酶同时酶切质粒，I %琼脂糖凝胶电泳，回收zmERF5启动子片段。使用HindIII和BamHI限制性内切酶同时酶切pBI121质粒载体，并回收载体片段。将zmERF2启动子片段与pBI121载体片段在体外进行链接，构建成pBI121-zmERF2-GUS载体，转化到农杆菌GV3101菌株中。5、转zmERF2启动子拟南芥植株的获得将含pBI121-zmERF2-GUS载体的GV3101农杆菌接种于LB液体培养基，加入利福平和卡那霉素至终浓度为100mg/L，28°C振荡培养。离心收集菌体，用ddH20稀释至OD =O. 8,每IOOml菌液加入5. Og鹿糖和50 μ I Silweet L-77。使用floral dip方法对拟南芥进行浸染，成熟后收获种子，将种子播在含100mg/L卡那霉素的MS固体筛选培养基上。从筛选培养基中长出的抗性植株，经PCR检测后确定为转zmERF2启动子阳性植株。6、zmERF2启动子活性的检测将转zmERF2拟南芥于苗期进行淹水处理，将正常生长和淹水处理的转基因拟南芥幼苗进行GUS组织化学染色。结果发现，在正常生长条件下，转zmERF2启动子拟南芥植株的根和叶片，未出现GUS染色的蓝色；而淹水条件下，转zmERF2启动子拟南芥的根呈现较强的⑶S蓝色，叶片未见⑶S蓝色。研究表明zmERF2启动子既是一个在根中表达的组织特异型启动子，同时也是一个淹水诱导表达的诱导型启动子。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为l)zmERF2启动子直接驱动外源基因的转基因植物，淹水条件下快速高效本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种绵玉米淹水胁迫响应zmERF2基因启动子，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜何为，程水源，黄敏，李琳玲，许锋，程华，
申请(专利权)人：黄冈师范学院，
类型：发明
国别省市：
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