本发明专利技术涉及到一个大豆来源的油体蛋白基因启动子及其应用，属于生物技术领域，涉及到改变粮食作物或经济作物种子品质和产量的基因工程领域。本发明专利技术包括种子特异性启动子序列SEQ?ID?NO.1，以及重组载体转化宿主组织，并表达下游基因改变种子成分的方法。本发明专利技术克隆的启动子对油料作物(大豆)种子品质和产量的提高具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及到一种从大豆中克隆到的油体蛋白基因种子特异性启动子序列及其应用。从大豆总DNA克隆到的这个种子特异性启动子并与目的基因连接到植物表达载体，导入植物中，使转基因植物种子中特异高效表达下游基因的方法和应用。
技术介绍
粮食作物(包括部分经济作物)中食用的部分主要是种子，，种子的品质和产量直接影响农业生产和人们的生活水平。在提高种子品质和质量的过程中，杂交是经典方法，通过选择两个性状好的父本和母本进行杂交，得到更理想的后代，但这个方法的缺陷就是周期太长。随着基因工程的发展，转基因则大大缩短了育种时间。在转基因工程研究的过程中，具有应用价值的外源基因在转基因植物中的表达往往达不到理想水平。而启动子是决 定基因表达的关键因素，选择合适的启动子对于转基因有着重要作用。根据启动子的转录模式可将启动子分为三类组成型启动子、组织特异性启动子和诱导启动子。组成型启动子在转基因工程中被广泛应用，如双子叶植物中应用的CaMV35S和CsVMV启动子，单子叶植物中应用的玉米Ubiqutin启动子和水稻的Actinl启动子。组织特异性启动子包括根特异性启动子(Yamamoto YT et al, 1992 ；Elmayan and Tepfer, 1995 ；Xu et al, 1995 ；Nitzet al, 2001 ；Vaughan et al, 2006 ；Vi jaybhaskar et al, 2008 ；Jeong et &1,2010)、莖特异性启动子(Bostwick et al, 1994)、花特异性启动子(van der Meer et al, 1990 ;Irishand Yamamoto, 1995 ；Rul 1 z-Rivero and Prat,1998 ；Maizel and Weigel, 2004；Chiouand Yeh, 2008 ;Verdonk et al, 2008)、果实特异性启动子(Montgomery et al, 1993 ；vanHaaren and Houck, 1993 ；Xu et al, 1996 ；Coupe and Deikman 1997 ；Deikman et al,1998 ；Moon and Callahan, 2004)和种子特异性启动子(Beachy R et al, 1985)等。诱导启动子包括缺水诱导启动子(Kasuga M et al, 1999 ；Xiao et al，2001 ；Rai M et al，2009)、低温诱导启动子(Seki M et al, 2001 ；Kasuga M et al, 2004 ;杜娟等，2005)、盐诱导启动子(Russell BL et al, 1998 ；Zhou SF et al, 2001 ；Aryadeep R et al, 2007)、损伤诱导性启动子(Farmer EE et al, 1994)和受病原菌诱导启动子(吕华飞等，1999 ;Sa Q et al, 2003 ；Peng JL et al, 2004)等。在组成型启动子的控制下，外源基因一般会在转基因植物所有部位和所有发育阶段都高量表达，这样会造成资源浪费，甚至会影响植物的生长发育，得不到理想的转基因植物。种子特异性启动子则可以很好的控制外源基因的表达，只在种子中高效表达，在其他部位和发育阶段几乎不表达。这就为提高种子的品质和产量奠定了很好的基础。在上个世纪80年代就开始有种子特异性启动子的研究，1985年Beachy等人(Beachy RN, et al. (1985)Accumulation and assembly of soybean β -conglycinin in seeds of transformedpetunia plants. The EMBO Journal, 4 (12), 3047-3053.)研究大豆伴球蛋白基因时发现，β_球蛋白的α-亚基启动子具有很强的时空调控性，在转基因植株中只在成熟过程中的种子中高效表达，而在其他部位和发育阶段几乎不表达。随后，其它种子特异性启动子被发现并克隆出来Baumlein等从野生大豆分离出来USP基因启动子(Baumlein H et al,1991) ；Russell等1997发现水稻谷蛋白I基因和玉米素基因启动子分别在胚乳和胚乳外层表达(Russell DA et al，1997);油菜napinB基因启动子可在种子中特异表达(Wu CYet al, 2000) ;Rossak等发现3_酮脂酰辅酶A合成酶启动子(Rossak M et al, 2001)在转基因拟南芥中开花5天后表达,9-11天后达到高峰；Hwang等发现水稻球蛋白启动子(HwangYS et al 2002) ;Kluth等发现gbssl基因上游40kb碱基与⑶S基因连接后转入植物发现其在小麦灌浆时表达，并进一步确定启动子序列为基因上游I. Okb (Kluth A et al，2002)；Sunikumar等从棉花胚cDNA中分离出1108bp的β-球蛋白B基因的启动子(Sunikumar Get al，2002) ;Mei等2004年发现的玉米中球蛋白启动子(Mei C et al，2004) ;Qu等将水稻SBEl基因启动子与⑶S连接后转入植物发现水稻种子盾片中表达(Qu LQ et al，2004)；丙氨酸氨基转移酶启动子和谷氨酸合成酶基因的启动子控制外源基因分别在胚乳内层和水稻盾片中表达(Qu LQ et al,2004)。
技术实现思路
技术问题本专利技术目的是提供一个大豆油体蛋白基因种子特异性启动子的序列，它能够使下游基因在种子中特异高效表达，在其他组织中或发育阶段几乎不表达，为提高农作物或经济作物种子的品质和产量提供重要元件。技术方案本专利技术提供了一个大豆来源的种子特异性启动子序列，其特征在于，该启动子的全长序列为SEQ ID NO. I。大豆油体蛋白基因表达模式鉴定步骤提取大豆(品种为“南农99-10”)各个发育阶段根、茎、幼叶、老叶、花、幼荚、老荚、未成熟种子和成熟种子的RNA，并反转成cDNA，设计引物(5’ CAATGTTCTCGTCCTCGCCG 3’ ；5’GATGGAGGTGATGCCGAAGA 3，)对基因做 RT-PCR，大豆 cons6 基因(Libault 等，2008)做内参对照，检测该基因各个发育阶段的表达情况。克隆该启动子序列和鉴定其功能如下步骤I.利用SDS法提取大豆总DNA。2.设计并合成如下一对引物引物I :5，GTCGACAACGTGGCTTGCACTTGTCTC 3，，引物2 :5 ’ GGATCCGGTATGGAAAGCGAGAGAGG 3 ’。3.以大豆总DNA为模版，用上述引物做PCR，将PCR片段和T载体连接，挑单菌落提取质粒测序，确定启动子序列。将阳性菌株提取的质粒和PBIlOl载体用Sal I和BamH I限制性内切酶进行双酶切，回收酶切片段并在4°C过夜连接，将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，37°C恢复I小时后涂板过夜培养。挑取单菌落提质粒测序，确定目的启动子序列。4.将连接好的重组载体，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大豆来源的种子特异性启动子，序列特征包括SEQ？NO.1所示的序列以及与它互补，同源，或该序列经过插入、突变几个核苷酸而形成的具有相同功能的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：章文华，赵江哲，柏杨，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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