本发明专利技术嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶、其发酵制备方法及发酵培养基，属于生物技术领域。所述蛋白酶通过下述方法制备所得：(1)以嗜麦寡养食单孢菌为菌种，在含有玉米粉、黄豆粉、MgSO4、NaCl和K2HPO4的液体发酵培养基中进行发酵；(2)将步骤(1)中培养36h的发酵液高速冷冻离心10min，取上清液，在上清液中缓慢地加入固体硫酸铵至80％饱和度，4℃下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷冻离心，取沉淀加入少量去离子水稀释即为含蛋白酶的粗酶液。本发明专利技术具有优化了难以发酵产酶的嗜麦寡养食单孢菌的发酵条件，为其发酵工业应用提供了基本参数的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶、其发酵制备方法及发酵培养基。
技术介绍
家蚕作为ー种重要的经济动物与鳞翅目昆虫研究模型，具有生长快、繁殖周期短的特点。在幼虫期20多天时，家蚕除了自身肠道分泌的消化酶具有消化食物的能力之外，肠道中种类繁多、数量巨大的微生物群体也对其食物的消化和营养的吸收起重要作用。同吋，由于长期家庭饲养的结果，家蚕防病能力极其脆弱；肠道内有益菌群的存在，能够有效地帮助家蚕抵制内源性细菌病害的侵袭。因此，肠道里的微生物对家蚕具有重要意义。国内研究者曾采用传统的培养手段初步调查了家蚕肠道微生物种类。已经发现的家蚕肠道主要菌群有肠球菌、葡萄球菌、阴沟肠杆菌和腊样芽孢杆菌。张剑飞等的研究发现了丰富的细菌种类和动态变化，其中微球菌和芽孢杆菌占优势。从这些研究中可以看出，虽然人们对家蚕肠道细菌有一定的认识，但可能是由于蚕种质资源及其肠道细菌的多祥性或者研究手段的差异，目前尚没有较为一致的意见。目前关于嗜麦寡养食单孢菌(Stenotrophomnas maltophilia)的报道多集中于其临床分布特点及其耐药性的研究，并且大多数学者认为该菌为非发酵菌。嗜麦寡养食单孢菌为革兰氏阴性菌，广泛存在于自然界中，也可寄居于人或动物的呼吸道和肠道。2003年杨丽等首次从环节动物双齿围沙蚕的消化道中发现了该菌，但对该菌发酵产蛋白酶的条件以及所产酶的酶学性质的研究还未见报道。
技术实现思路
本专利技术在不同发酵条件下对嗜麦寡养食单孢菌进行培养，将得到的含蛋白酶粗提取液用硫酸铵进行盐析，得到的固体溶于稀盐中，控制不同酶促反应条件，研究酶学性质，在微生态制剂的研究方面有一定的实际意义。本专利技术的目的在于公开了嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶。本专利技术的第二个目的在于公开了嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的发酵制备方法。本专利技术的第三个目的在于公开了嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的发酵培养基。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶，所述嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶通过下述方法制备所得(I)、以嗜麦寡养食单孢菌为菌种，在液体发酵培养基中进行发酵，35°C下培养36h ;其中发酵培养基中各物质的质量体积分数为玉米粉I. 0% (即IOOml水溶液中含有玉米粉的量为I. Og)、黄豆粉1.0%、MgSO4 0.04%, NaCl I. 5%和K2HPO4 0.1%，发酵培养基的PH值为7. 0，发酵培养基的装液量60% ；(2)、将步骤(I)中培养36h的的发酵液4°C下4000r/min高速冷冻离心IOmin,取上清液，在上清液中缓慢地加入固体硫酸铵至80%饱和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷冻离心，取沉淀加入去离子水稀释即为含蛋白酶的酶液。上述技术方案中所述的嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶，其中，所述嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的酶促反应温度为45°C -55°C ;酶促反应pH值为9. O。上述技术方案中所述的嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶，其中，所述嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的酶促反应温度为50°C。上述技术方案中任一技术方案所述的嗜麦寡养食单胞菌蛋白酶，其中，嗜麦寡养食单孢菌在液体发酵培养基中进行发酵步骤之前还包括将嗜麦寡养食单孢菌接种于富集培养基中摇床培养6h的富集培养步骤，所述富集培养基的制备方法为称取胰化蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g，NaCl lg，溶解并定容于IOOmL容量瓶中，高压灭菌。 嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的发酵制备方法，所述制备方法包括下述步骤(I)、以嗜麦寡养食单孢菌为菌种，在液体发酵培养基中进行发酵，35 °C下培养36h ;其中发酵培养基中各物质的质量体积分数为玉米粉I. 0%，黄豆粉I. 0%，MgS04O.04%, NaCl I. 5%, K2HPO4 O. I%，发酵培养基的pH值为7. O，发酵培养基的装液量60% ;(2)、将步骤(I)中培养36h的的发酵液4°C下4000r/min高速冷冻离心IOmin,取上清液，在上清液中缓慢地加入固体硫酸铵至80%饱和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷冻离心，取沉淀加入去离子水稀释即为含蛋白酶的酶液。嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的发酵制备方法，所述发酵制备方法包括下述步骤(I)、将嗜麦寡养食单孢菌接种于富集培养基中摇床培养6h的富集培养步骤，所述集培养基的制备方法为称取胰化蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g, NaCl lg,溶解并定容于IOOmL容量瓶中，高压灭菌；(2)、以富集培养的嗜麦寡养食单孢菌为菌种，在液体发酵培养基中进行发酵，35 0C下培养36h;其中发酵培养基中各物质的质量体积分数为玉米粉1.0%，黄豆粉1.0%, MgSO4O. 04%, NaCl I. 5%, K2HPO4 O. I %，发酵培养基的pH值为7. O，发酵培养基的装液量60% ；(3)、将步骤(2)中培养36h的的发酵液4°C下4000r/min高速冷冻离心lOmin，取上清液，在上清液中缓慢地加入固体硫酸铵至80%饱和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷冻离心，取沉淀加入去离子水稀释即为含蛋白酶的酶液。嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的发酵培养基，其中，所述发酵培养基中各物质的质量体积分数为玉米粉1.0%，黄豆粉1.0%，MgSO4 O. 04%, NaCl I. 5%, K2HPO4 0.1%，发酵培养基的pH值为7.0。本专利技术具有以下有益效果I、本专利技术在从家蚕肠道分离出嗜麦寡养食单孢菌的基础上，进ー步公开了嗜麦寡养食单孢菌的发酵培养条件及其所产蛋白酶的酶学性质。2、本专利技术在优化了难以发酵产酶的的嗜麦寡养食单孢菌的发酵条件，获得了其最佳发酵參数，为其发酵エ业应用提供了基本參数。3、本专利技术所获得的嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶具有较强的降解动物源蛋白质能力，特别是在降解动物毛发方面具有较强的应用潜力。附图说明I、图I为培养温度对嗜麦寡养食单孢菌产蛋白酶的影响；2、图2为培养时间对嗜麦寡养食单孢菌产蛋白酶的影响；3、图3为pH值对嗜麦寡养食单孢菌产蛋白酶的影响；4、图4为温度对蛋白酶活力的影响；5、图5为pH值对蛋白酶活力的影响；6、图6为蛋白酶的热稳定性；7、图7为蛋白酶的pH稳定性。 具体实施例方式为使本专利技术的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本专利技术作进ー步的说明，本专利技术实施例和试验例所采用的材料和方法如下一、材料和方法I、材料与试剂分离自5龄家蚕肠道内容物的嗜麦寡养食单胞菌株，由安徽农业大学生命科学学院生理学教研室提供，也可从市场购买；福林-酚试剂，酪蛋白，三氯こ酸，碳酸钠，Imol/LNaOH溶液，pH7. 4磷酸缓冲液。2、主要仪器分光光度计722S，台式电子天平，可调恒温水浴锅HH-2，高速冷冻离心机，精密pH计，高温蒸汽灭菌锅，恒温摇床，IOOOul微量移液器。3、培养基的制备(I)、富集培养基称取胰化蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g，NaCl lg，溶解并定容于IOOmL容量瓶中，高压灭菌，即得富集培养基。(2)、发酵培养基称取玉米粉1.08，黄豆粉1.(^，1%304 0 . 048，恥(1 I. 5g, K2HPO4O.lg，置于IOOml锥形瓶中混合加水至IOOml煮沸，冷却后，高压灭菌，即得发酵培养基。4、1%酪蛋白溶液的配制；称取O. 25g酪蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶，所述嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶通过下述方法制备所得：(1)、以嗜麦寡养食单孢菌为菌种，在液体发酵培养基中进行发酵，35℃下培养36h；其中发酵培养基中各物质的质量体积分数为玉米粉1.0％、黄豆粉1.0％、MgSO4？0.04％、NaCl？1.5％和K2HPO4？0.1％，发酵培养基的pH值为7.0，发酵培养基的装液量60％；(2)、将步骤(1)中培养36h的发酵液4℃下4000r/min高速冷冻离心10min，取上清液，在上清液中缓慢地加入固体硫酸铵至80％饱和度，4℃下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷冻离心，取沉淀加入去离子水稀释即为含蛋白酶的酶液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王在贵，李阿敏，刘朝良，刘金阳，李大辉，刘华霞，曹双凤，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：
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