本发明专利技术公开了一种极耐热木糖苷酶及其编码基因和应用，该极耐热木糖苷酶的氨基酸序列如SEQNO：1所示。该木糖苷酶具有优良的耐热性能。在95℃、pH为6.0的条件下酶活性最高，比酶活达到117.6U/mg；该蛋白酶在温度为75-100℃、pH为5.0-7.5的范围内，均具有较高的酶活。该木糖苷酶的耐热性能极高，在85℃反应体系中，保温1h酶活性基本保持不变。上述特性使得本发明专利技术得到的木糖苷酶比现有木糖苷酶具有更大的优越性，适用于80℃以上高温、偏中性的pH条件下木寡糖的降解，具有潜在的工业应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程技术及纤维原料水解领域，具体涉及一种极耐热木糖苷酶及其编码基因和应用。
技术介绍
木聚糖是植物细胞壁半纤维素的土要成分，是除纤维素之外自然界中最为丰富的可再生资源之一。木糖就存在于半纤维素多缩戊糖中，是亟待开发的重要可再生资源。如果将半纤维素生物降解为木糖和少量其它单糖，可以用作基本碳源生产各种发酵产品、工业酒精及糠醛制备等。同时，木糖的衍生物木糖醇还可作为食品添加剂，如用于口香糖、糖果及于尿病患者的甜味剂等。木糖苷酶是木聚糖降解酶系中的较为关键的多糖水解酶，通过随机切割木寡糖的 β -I, 4-糖苷键，将木寡糖降解为木糖。由于木糖苷酶可以将寡糖降解为木糖，因此可作为一种高效的工业酶制剂用于木糖及木糖衍生物的生产，因此具有潜在的应用价值。
技术实现思路
专利技术目的针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种极耐热木糖苷酶，以使其满足使用要求。本专利技术的另一目的是提供一种编码上述极耐热木糖苷酶的核苷酸序列。本专利技术还有一目的是提供上述一种极耐热木糖苷酶的应用。技术方案为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下 一种极耐热木糖苷酶，氨基酸序列如SEQ NO 1所示。一种极耐热木糖苷酶，氨基酸序列为权利要求I所述的SEQ NO :1序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有木糖苷酶活性的衍生蛋白质。一种编码上述的极耐热木糖苷酶的基因，DNA序列如SEQ NO 2所示。一种可表达上述的极耐热木糖苷酶的重组体系，在所述的重组体系上克隆有如SEQ NO 2所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。一种扩增上述的编码极耐热木糖苷酶的基因的方法，所使用的引物对为Xylo-I :5’ - GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’ ；Xylo-2 :5’ -CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’。上述的极耐热木糖苷酶在酶解木寡糖中的应用。酶解反应温度为75-100°C，PH5. 0-7. 5。所述的木寡糖来源于纤维原料中的半纤维素，包括木二糖、木三糖和木四糖。上述的重组体系在酶解木寡糖中的应用。上述的极耐热木糖苷酶在酶解玉米秸杆的木寡糖中的应用。有益效果与现有技术相比，本专利技术所提供的木糖苷酶具有优良的耐热性能。在95°C、pH为6.0的条件下酶活性最高，比酶活达到117. 6U/mg ;该蛋白酶在温度为75-100°C, pH为5. 0-7. 5的范围内，均具有较高的酶活。该木糖苷酶的耐热性能极高，在85°C反应体系中，保温Ih酶活性基本保持不变。上述特性使得本专利技术得到的木糖苷酶比现有木糖苷酶具有更大的优越性，适用于80°C以上高温、偏中性的pH条件下木寡糖的降解，具有潜在的工业应用价值。附图说明图I是木糖苷酶Tth xylo的SDS-PAGE蛋白电泳 图2是Tth xylo的最适温度结果 图3是Tth xylo的最适pH结果 图4是Tth xylo的热稳定性结果 图5是Tth xylo降解玉米秸杆半纤维素TLC图。 具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。以下实施例中所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例I嗜热陆地热泉高温神袍菌基因组DNA的提取 采用嗜热陆地热泉高温神袍菌Thermo toga thermarum DSM5069 (购自德国微生物菌种保藏中心)新鲜菌体10g，悬于5mL 50mM Tris缓冲溶液中(pH8. 0)，混匀后在37°C放置20min，然后加入2mL 10%SDS，55°C放置5min，用等体积的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清液加入2倍体积的无水乙醇，于_20°C放置30min，4°C 13000rpm离心20min，收集沉淀。沉淀溶于 0. 5mL TE 缓冲液(ρΗ8· 0，IOmM Tris, ImM EDTA)，加入 10mg/mL RNase 3μ L,37°C保温lh，用等体积的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清加入2倍体积的无水乙醇，于_20°C放置30min，4°C 13000rpm离心20min，收集沉淀，真空冷冻干燥，用0. 5mL超纯水溶解。实施例2木糖苷酶基因Tth xylo的制备 可采用如下方法制备Tth xylo基因，也可以采用人工合成的方式得到。认Thermotoga thermarum DSM5069的总DNA (实施例I制备)为模版，用下述引物对进行PCR扩增Xylo-I :5’ - GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’ ；Xylo-2 :5’ -CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’ ； 引物合成时，Tth-I引入Nde I酶切位点，Tth-2引入Xho I酶切位点。PCR 反应体系I μ L T. thermarum 基因组 DNA, 1μ L Tth-1, IuL Tth-2, 25 μ LPremix ExTaq, 22 μ L 超纯水。PCR 反应条件94°C变性 5min ;94°C变性 30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸 3min，30Cycles ;72°C延伸 IOmin ;4°C保温。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化(BI0MIGA，上海)。实施例3重组克隆、表达载体pET-20b-7iA xylo的构建与验证 将纯化过的PCR产物(实施例2制备)、pET-20b (Novagen)用分别Nde I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切酶切PCR及载体大片段。割胶回收后的目的片段与载体，经浓缩加入8yL无菌水重悬，加入IyL IOXLigase Buffei^PlyL Ligase，于16°C连接过夜。用连接反应产物转化大肠杆菌pET-20b，然后涂于含IOOy g/mL Amp (氨苄青霉素)的培养皿，37°C培养 10-12h。从转化平板上挑取多个单菌落，采用BI0MIGA的质粒小量提取试剂盒提取质粒。对获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示，pET-20b载体中插入了所克隆的目的片段(核苷酸长度为2322 bp)，进而得到重组克隆、表达载体pET-20b-m xylo, Tth xylo的核苷酸如SEQ NO 2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ NO I所示，将该蛋白命名为Tth xylo。实施例4重组木糖苷酶Tth xylo的表达与纯化 将重组克隆、表达载体pET-20b-Tth xylo (实施例3制备)电转至宿主菌疋coliBL21(DE3) (Novagen)，获得含有重组质粒的重组菌。将单菌落的重组菌接种于5mL含有100 μ g/ml氨节青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培养基,在37°C温度下,200rpm震荡培养8-12h。将上述4mL菌液接种于含400mL培养基的1000 mL摇瓶中，37°C温度下，200rpm震荡培养，当吸光度达到0. 6-0. 8时，加人200 μ L的IM IPTG，并在30°C温度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种极耐热木糖苷酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQ？NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王飞，时号，李迅，钱方军，
申请(专利权)人：南京林业大学，沭阳祥泰生物能源科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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