优化的纤维素酶制造技术

本发明专利技术公开了具有优化特性的用于处理含纤维素和木质纤维素物质的纤维素酶。具体而言，公开了具有优选特性的纤维二糖水解酶。本发明专利技术提供这些酶的融合、插入、缺失和/或替换变异体。酶变异体具有增强的热稳定性、蛋白水解稳定性、比活性和/或在极端pH下的稳定性。公开了编码这些酶的核酸分子、包含该酶的组合物、制备方法、和在纤维素处理和/或生物燃料制备中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术公开了具有优化特性的用于处理含有纤维素和含有木质纤维素底物的纤维素酶。具体而言，公开了具有优选特性的纤维二糖水解酶。本专利技术提供这些酶的融合、插入、缺失和/或替换变体。酶变体具有增强的热稳定性、蛋白水解稳定性、比活性(specificactivity)和/或在极端pH下的稳定性。公开了编码该酶的核酸分子、包含该酶的组合物、制备方法以及用于纤维素处理和/或用于生物燃料生产中的用途。
技术介绍
极其需要发展基于可再生资源的生产方法，例如用于由纤维素和木质纤维素材料生成乙醇。 纯的纤维素材料、或其与半纤维素和/或木质素的组合是有价值的并且是容易获得的用于生产化学品和燃料的原材料。纤维素和木质纤维素加工的重要步骤是β-1，4-连接葡萄糖聚合物纤维素(β-1，4-linked glucose polymer cellulose)的水解以及随后的葡萄糖单体和短葡萄糖低聚物例如纤维二糖、纤维三糖等的释放。在多种能降解和水解纤维素的生物特别是丝状真菌和细菌中发现了催化该反应的酶。已知用于将固体木质纤维素的生物质转化为可燃烧的燃料产物的连续工序。使纤维素底物更易被酶降解的处理包括碾磨、化学处理和/或水热处理。实例是湿式氧化和/或蒸汽喷发(steam explosion)。这样的处理提高了纤维素纤维的可及性(accessibility)并使它们与半纤维素和木质素分离开。文献中已知很多的用于将处理过的生物质水解的酶混合物。通常需要内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β_葡萄糖苷酶的混合物来进行纤维素聚合物的降解。在这些纤维二糖水解酶(CBH)中，更具体地，纤维二糖水解酶I (CBHI)在水解步骤中起重要作用，因为它们提供最持续的(processive)酶活性。CBHI酶催化纤维二糖从纤维素聚合物还原端上持续的水解释放。(Lynd LR, Weimer PJ, van Zyl WH, Pretorius IS. Microbialcellulose utilization:fundamentals and biotechnology. Microbiol Mol BiolRev. 2002Sep;66(3) :506-77)。水解的纤维素材料包含若干种可以从混合物中分离出来的有价值的碳水化合物分子。含糖的纤维素材料水解产物可以用于多种精细化学品或生物聚合物的微生物生产，例如有机酸、乙醇或高级醇(即二元醇或多元醇)或聚羟基脂肪酸酯(PHA)。糖类水解产物的主要用途之一是生物燃料的制备。Kurabi等人(2005)描述了从里氏木霉(Trichoderma reesei)和其他真菌例如青霉菌(Penicillium sp.)中制备纤维素酶。基于经蒸汽喷发和乙醇有机溶剂预处理过的黄旗松(Douglas-fir)对性能进行了分析。酶混合物的更佳性能似乎是单组分酶的性质改善以及混合物中各化合物作用的结果，特别是β_葡萄糖苷酶的存在。(KurabiA，Berlin A，Gilkes N，Kilburn Dj Bura R，Robinson Jj Markov A, Skomarovsky A,GusakovA, Okunev 0，Sinitsyn A，Gregg Dj Xie D，Saddler J. (2005) Enzymatic hydrolysis ofsteam-exploded and ethanol organosolv-pretreated Douglas-Fir by novel andcommercial fungal cellulases. Appl Biochem Biotechnol.121-124:219-30)。 领域内从一些真菌源得知了葡糖水解酶(glucohydrolase) 7型(cel7)的纤维二糖水解酶序列。已知埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的Cel7纤维二糖水解酶,并报道过其在大肠杆菌(Escherichia coli) (Grassick A, Murray PG，Thompson R, CollinsCM, Byrnes L, Birrane G, Higgins TM, Tuohy MG. Three-dimensional structure of athermostable native cellobiohydrolase, CBH IB, and molecular characterizationof the cel7gene from the filamentous fungus, Talaromyces emersonii. Eur J Biochem. 2004Nov;271(22):4495-506)和酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevistae)(Voutilainen SP, Murray PG, Tuohy MG, Koivula A. Expression of Talaromycesemersonii cellobiohydrolase Cel7A in Saccharomyces cerevisiae and rationalmutagenesis to improve its thermostability and activity. Protein Eng DesSel.2010Feb;23(2) :69-79)中的表达，然而，蛋白或是产出为失活形式的或者是收率非常低(小于或等于5mg/l)。从肉座菌属(Hypocrea)或木霉属(Trichoderma)的野生型或工程菌中可以以高收率产生红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)纤维二糖水解酶I。红褐肉座菌 Cel7A 的改进序列在 US7459299B2、US7452707B2、W02005/030926、W001/04284A1 或US2009/0162916A1 中公开。从已报道的热稳定性酶的序列比对中推断出、并从已确定位置的结构信息和重排(shuffling)以及接下来的限制筛选中暗示出引起改进的位点。已报道，通过应用非常敏感且以非常严格的方式与原物质(native substrate)类似的荧光物质，在可转化生物例如酿酒酵母中来进行较大库的筛选。(Percival Zhang YH, Himmel ME, Mielenz JR. Outlook forcellulase improvement: screening and selection strategies. Biotechnol Adv. 2006Sep-Oct;24(5):452-81)。报道了由其他真菌体系例如嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)、Chrysosporium Iucknowense 或黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)生产纤维二糖水解酶。报道了由酵母表达Cel7纤维二糖水解酶，但是酶的收率或酶特性仍然不佳° (PenttilS ME, Andr6 L, Lehtovaara P, Bailey M, Teeri TT, Knowles JK. Efficientsecretion of two 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.02.11 EP 1015335521.一种具有纤维二糖水解酶活性的多肽，其中所述多肽包括与SEQ ID NO :5基于437位的序列长度具有至少60%序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述多肽在于62°C或更高的温度下进行转化60分钟后保持其最大底物转化能力的50%。2.根据权利要求I所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQID NO 5基于437个氨基酸残基的序列长度具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。3.根据权利要求I或2所述的多肽，其中SEQID NO 5所定义序列中的一个或多个氨基酸残基， 在SEQ ID NO 5的氨基酸I 437中的一个或多个优选选自Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、P12、T15、A21、G23、S24、T26、T27、Q28、N29、G30、A31、V32、N37、W40、V41、G46、Y47、T48、N49、C50、T52、N54、D57、T59、Y60、D64、E65、A68、Q69、A72、V84、S86、S89、S90、K92、S99、Q109、D110、Dill、1116、F117、K118、L119、L120、D129、V130、G139、A145、M146、V152、K154、Y155、N157、N158、K159、K163、G167、Q172、F179、I180、D181、E183、E187、G188、Q190、S192、S193、N194、I200、D202、H203、D211、V212、A221、P224、D228、T229、G231、T233、M234、S236、T243、Y244、S245、N246、D247、G251、F260、G266、K275、1276、1277、T280、L290、D293、G294、T295、T297、T299、S301、K304、F306、N310、S311、V313、I314、N318、D320、1321、T325、N327、T335、A340、F341、D343、T344、D345、D346、Q349、H350、A354、K355、A358、Q361、Q362、G363、M364、V367、D373、Y374、A375、A376、P386、T387、D390、T392、T393、P394、T400、P402、T403、D404、D410、N417、S418、T421、Y422的位置上通过替换或缺失，和/或其位置G151、K159后通过一个或多个插入而被修饰； 在更优选的实施方式中，在SEQ ID NO 5的氨基酸I 437中的一个或多个选自Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、A21、S24、T26、T27、Q28、N29、G30、W40、Y47、D64、E65、A68、Q69、A72、S86、K92、K118、Y155、D181、E183、Q190、S192、N194、D202、H203、P224、T229、G231、M234、S236、T243、D247、S311、N318、D320、T335、A340、T344、D346、Q349、K355、Y374、A375、T387、D390、T392、T393、Y422的位置上通过替换或缺失，和/或其位置G151、K159后通过一个或多个的8个氨基酸插入而被修饰； 在SEQ ID NO :5的氨基酸I 437中的一个或多个选自Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、Q28、E65、A72、S86、D181、E183、D202、P224、S311、N318、D320、T335、D346、Q349、T392、T393、Y422的位置上通过替换或缺失，和/或其位置G151、K159后的一个或更多中通过插入，和/或其位置G151、K159后通过一个或多个的5个氨基酸插入而被修饰。4.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQID NO:5基于437个氨基酸残基的序列长度具有至少85%的序列一致性的氨基酸序列。5.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQID NO:2基于500个氨基酸残基的序列长度具有至少85%的序列一致性的氨基酸序列。6.根据权利要求5所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQID NO 2基于500个氨基酸残基的序列长度具有至少90%、优选至少95%、更优选至少99%的序列一致性的氨基酸序列。7.根据前述权利要求中的一项或多项所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列具有SEQ ID NO 2所定义的序列，其中f 75个氨基酸残基、更优选f 35个氨基酸残基被替换、缺失或插入。8.根据权利要求7所述的多肽，其中SEQID NO :2所定义的序列中的一个或多个以下氨基酸残基， 优选在 SEQ ID NO 2 的氨基酸 Γ500 中的位置 QU Q2、G4、A6、T7、A8、N10、P12、T15、A21、G23、S24、T26、T27、Q28、N29、G30、A31、V32、N37、W40、V41、G46、Y47、T48、N49、C50、T52、N54、D57、T59、Y60、D64、E65、A68、Q69、A72、V84、S86、S89、S90、K92、S99、Q109、D110、Dill、I116、F117、K118、L119、L120、D129、V130、G139、A145、M146、V152、K154、Y155、N157、N158、K159、K163、G167、Q172、F179、1180、D181、E183、E187、G188、Q190、S192、S193、N194、I200、D202、H203、D211、V212、A221、P224、D228、T229、G231、T233、M234、S236、T243、Y244、S245、N246、D247、G251、F260、G266、K275、1276、1277、T280、L290、D293、G294、T295、T297、T299、S301、K304、F306、N310、S311、V313、1314、N318、D320、1321、T325、N327、T335、A340、F341、D343、T344、D345、D346、Q349、H350、A354、K355、A358、Q361、Q362、G363、M364、V367、D373、Y374、A375、A376、P386、T387、D390、T392、T393、P394、T400、P402、T403、D404、D410、N417、S418、T421、Y422、F427、P429、I430、G431、T433、G434、N435、P436、S437、G439、N440、P441、P442、G443、N445、R446、T448、T449、T450、T451、R453、P454、A455、T456、T457、G459、S460、S461、P462、G463、P464、T465、S467、H468、G470、C472、G474、G476、Y477、S478、P480、V482、C483、S485、G486、T488、C489、Q490、V491、L492、N493、Y495、Y496、Q498、C499、L500上通过替换或缺失，和/或其位置G151、K159、G434、A455或P464后通过一个或多个插入而被修饰； 在更优选的实施方式中，在SEQ ID NO:2的氨基酸I 500中的一个或多个选自Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、A21、S24、T26、T27、Q28、N29、G30、W40、Y47、D64、E65、A68、Q69、A72、S86、K92、K118、Y155、D181、E183、Q190、S192、N194、D202、H203、P224、T229、G231、M234、S236、T243、D247、S311、N318、D320、T335、A340、T344、D346、Q349、K355、Y374、A375、T387、D390、T392、T393、Y422、P436、P442、N445、R446、T448、T451、R453、P462、G463、H468、P480、V482、S485的位置上通过替换或缺失，和/或其位置G151、K159、G434、A455或P464后通过一个或多个的8个氨基酸插入而被修饰； 在还更优选的实施方式中，在SEQ ID NO 2的氨基酸1 500中的一个或多个选自Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、Q28、E65、A72、S86、D181、E183、D202、P224、S311、N318、D320、T335、D346、Q349、T392、T393、Y422、P442、N445、R446、H468、V482 的位置上通过替换或缺失，和 /或其位置G151、K159、G434、A455或P464后的一个或更多中通过插入，和/或其位置G151、K159、G434、A455或P464后通过一个或多个的5个氨基酸插入而被修饰。9.根据权利要求8所述的多肽，其中SEQ ID NO :2所定义序列中的一个或多个以下氨基酸残基被修饰如下10.根据前述权利要求中的一项或多项所述的多肽，其中所述多肽具有选自以下SEQID NO 2突变列表中的氨基酸序列11.根据前述权利要求中的一项或多项...

【专利技术属性】
技术研发人员：U克特林，C赖辛格，T布吕克，A科尔特曼，J格拉赫，I翁特施特拉塞尔，L吕歇尔，M赖巴赫，J克拉伦，A科尔，JC皮克，D施洛瑟，
申请(专利权)人：南方化学知识产权有限公司，
类型：
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