一种胃癌细胞的核酸适配体序列及用途制造技术

本发明专利技术属细胞生物技术领域，涉及一种胃癌细胞的核酸适配体序列及用途。本发明专利技术采用核酸适配体的体外SELEX筛选技术，以胃癌细胞株HGC27为正筛靶标，以胃粘膜上皮细胞株GES-1为反筛靶标，并筛选与HGC27特异结合的核酸适配体，获得具有特异结合HGC27的特征序列GGTTT。本发明专利技术所述的特征序列是核酸适配体与HGC27特异性结合的基础，可用于抗胃癌的药物设计、制备药物或其他制品；所述的含该特征序列的核酸适配体，可作为抗胃癌的分子探针或药物靶点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属细胞生物
，涉及一种胃癌细胞的核酸适配体序列及用途。
技术介绍
胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，也是最常见的消化道恶性肿瘤。据统计，胃癌在我国的患病率位居各类肿瘤的第二位；在所有胃的恶性肿瘤中，腺癌占到95%。临床上大多数胃癌病人确诊时往往已经处于晚期，其5年生存率不超过10%，因此早期诊断是提高胃癌生存率的关键，而寻找早期诊断的肿瘤标志物对于胃癌的诊断和治疗则具有十分重要的意义。目前，已知核酸适配体(aptamer)是经体外筛选技术筛选出的能特异结合金属离子、多肽、蛋白质乃至整个细胞的寡聚核苷酸(DNA或RNA)片段；其特异性如同抗体一样，对 可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适配体的体外筛选技术被称为指数富集的配体系统进化(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术；所述的SELEX技术模拟自然进化过程，对随机寡核苷酸文库施加选择压力(结合靶目标)，淘选与靶目标高度特异结合片段(如图I所示)；相比抗体等多肽类的适配体(peptide aptamer),核酸适配体的优势相当明显,如制备简单快捷、化学性质稳定、至今未见报道存在免疫原性或毒性、靶分子范围广、亲和力高、特异性强、易于进行改造修饰。核酸适配体的诸多优势令其在基础研究、临床检测、新药开发等方面有着广泛的用途。在临床检测方面，目前能用抗原抗体反应进行检测的技术几乎都可用核酸适配体替代，如Archemix公司开发的一种适配体分子传感器-RiboReporter 即可将检测到的蛋白信号直接转化成光信号记录并分析，从而实现了对生物混合液(如血清、细胞提取物)中的大分子蛋白的直接快速检测。在新药开发方面，最典型的例子便是第一个通过美国FDA批准上市的核酸适配体药物Macugen，其为抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)的核酸适配体，被用于治疗湿性老年性黄斑变性(wet AMD)。另一个核酸适配体药物的例子是由Aptamera公司研制的AGRO100，临床前试验表明，AGR0100对多种癌细胞均有抑制作用。目前，国际上大部分从事核酸适配体研究的科学家和生物技术公司主要针对心血管疾病，而较少关注中国人的常见疾病，如肝炎、肝癌、胃癌等，因此本专利技术优先考虑核酸适配体如何应用于上述严重威胁我国人民健康的重大疾病，开发针对胃癌细胞的核酸适配体作为特征性标志物，为胃癌的分子诊断和靶向治疗提供有力支持，具有重要的临床价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种胃癌细胞的核酸适配体序列，具体涉及一种胃癌细胞株HGC27的核酸适配体中具有特异结合HGC27的特征序列。本专利技术中，所述的胃癌细胞株HGC27的核酸适配体(序列I)中含有特异结合HGC27的特征序列，所述的特征序列为GGTTT。本专利技术中，所述的胃癌细胞选自胃癌细胞株HGC27。本专利技术的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本专利技术中根据对该序列分析，可进一步设计抗胃癌的药物或制品，并制备抗胃癌的药物或其他制品。本专利技术采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以胃癌细胞株HGC27为正筛靶标，以胃粘膜上皮细胞株GES-I为反筛靶标，筛选与HGC27特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合HGC27的特征序列GGTTT，本发 明中命名为华山适配体2号，简称HSST02。本专利技术通过下述技术方案实现采用已知的核酸适配体的体外筛选技术即SELEX技术，以胃癌细胞株HGC27(购自上海细胞库)为正筛靶标，以胃粘膜上皮细胞株GES-I (购自上海细胞库)为反筛靶标，从体外合成的随机寡聚 DNA 文库(5’_acgctcggatgccactacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNctcatggacgtgctggtgac-3’)中筛选出与HGC27特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物 Aptamer_L(5’ -FAM-acgctcggatgccactacag-3’ )和 Aptamer_R(5’ -biotin-gtcaccagcacgtccatgag-3’)进行扩增并进行TA克隆入pMD19_T载体(购自上海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司);挑去白色菌落以引物RV-M(5’-GAGCGGATAACAATITCACACAGG-3’ )和 M13(_47) (5，-CGCCAGGGITITCCCAGTCACGAC-3 ’ )进行 PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并用M13(-47) (5’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’ )为测序引物进行测序反应，上测序仪测序；根据测序结果分析特征序列。本专利技术中，所述的序列选自天然存在或人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列；所述的核酸适配体的序列含有与所述特征序列的核苷酸的全部相同的序列，即所有核酸适配体均含有所述的特征序列。本专利技术以胃癌细胞株HGC27为正筛靶标，以胃粘膜上皮细胞株GES-I为反筛靶标，经体外筛选技术，获得具有特异结合HGC27的核酸适配体的特征序列GGTTT，以该特征序列为核酸适配体与HGC27特异性结合的基础，进一步用于抗胃癌的药物设计、制备药物或其他制品；所述的含该特征序列的核酸适配体，可作为抗胃癌的分子探针或药物靶点。附图说明图I为核酸适配体的体外筛选技术即SELEX技术的一般流程图。具体实施例方式实施例I :核酸适配体筛选(一轮)首轮寡聚DNA 文库序列5’ -acgctcggatgccactacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc t cat ggac gt gc t ggt gac-3，富集所用引物Aptamer_L :5，-FAM-acgctcggatgccactacag-3 Aptamer_R :5，-biotin-gtcaccagcacgtccatgag-3，将寡聚DNA文库测定0D260后，离心干燥；用300ul结合缓冲液(PBS中含4. 5g/L 葡萄糖，5mM MgCl2, 2mg/mL BSA,0. 2mg/mL 酵母 tRNA)溶解文库，取 250pmol (第一轮IOnmol),95°C 5min,迅速置冰上，稍后快速离心。反筛将250pmol的文库吸入GES-1生长覆盖度达到70 80%的直径6cm培养皿中，用结合缓冲液补足到ImL ;4°C摇床振荡Ih ;取上清液。正筛将反筛上清液加入HGC27生长覆盖度达到70 80%的直径6cm培养皿中中，4°C摇床振荡Ih ;弃上清液；用洗涤缓冲液(PBS中含4. 5g/L葡萄糖，5mM MgC12)洗涤HGC27细胞三遍；用细胞刮刮下HGC27细胞，用ImL洗涤缓冲液将HGC27细胞转移到EP管中，95°C 5min，迅速置冰上。待变冷后，IOOOOrpm离心5min ;上清转移到一干净的EP管中。富集配置PCR 体系(总体积 IOOOul) =H2O 740ul, 10XPCR 缓冲液 IOOul, dNTP80ul，引物混合物 25ul(H20 100uMAptamer_L 100uMAptamer_R = 4 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胃癌细胞的核酸适配体序列，其特征在于，具有序列1的结构，其含有特异结合胃癌细胞株HGC27HGC27的特征序列GGTTT。

【技术特征摘要】
1.一种胃癌细胞的核酸适配体序列，其特征在于，具有序列I的结构，其含有特异结合胃癌细胞株HGC27HGC27的特征序列GGTTT。2.按权利要求I所述的胃癌细胞的核酸适配体序列，其特征在于，通过下述方法制得采用核酸适配体的体外SELEX筛选技术，以胃癌细胞株HGC27为正筛靶标，以胃粘膜上皮细胞株GES-I为反筛靶标，筛选与胃癌细胞株HGC27特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合HGC27的特征序列GGTTT。3.按权利要求I所述的胃癌细胞的核酸适配体序列，其特征在于，所述的序列选自天然存在或人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。4.按权利要求I所述的胃癌细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘杰，张骏，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：