本发明专利技术公开了一种靶向人高转移肝癌细胞的ssDNA适配子及其应用，涉及肝癌转移复发的诊治领域，为肝癌转移复发的诊治提供了一种高效特异的靶向性新型分子。本发明专利技术应用消减cell-SELEX技术，以遗传背景相同但转移潜能有明显差异的两个肝癌细胞系MHCC97-L(低转移)和HCCLM9(高转移)分别为消减靶子和筛选靶子，筛选出能特异识别高转移潜能肝癌细胞HCCLM9的ssDNA适配子。该适配子是能特异结合人高转移肝癌细胞膜表面的单链DNA分子探针，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。该适配子在制备诊断或治疗肝癌的试剂中可望发挥重要作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肝癌转移复发的诊断与治疗
，具体涉及一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子及其应用，可用于肝癌转移复发的靶向诊疗。
技术介绍
肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，占全部恶性肿瘤的6%，中国是世界上肝癌死亡率最高的国家，占世界上肝癌总死亡人数的53%，在中国已成为恶性肿瘤第2位的死因。尽管近几十年以来在肝癌诊治和基础研究 方面均取得了长足的进步，但总体而言，肝癌的预后并没有得到显著的改善，5年生存率仅为5%左右。目前，临床主要依靠定期复查甲胎蛋白AFP等血清学标志物和B超等影像学检查来发现术后的转移复发，但AFP阳性的肝癌只有70%-80%，B超无法发现小于Icm的肝癌，诊断均存在盲区，不能准确及时预测。因此进行筛选HCC转移相关的靶分子用来预测并干预转移复发的研究尤为重要。近年来发展起来的SELEX (systematic evolution of ligands by exponentialenrichment)技术是九十年代发展起来的一种新的体外筛选技术，它运用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得高亲合力、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers)，已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、药物、氨基酸以及各种细胞因子等，甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子和朊病毒等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲合性和特异性，具有良好的应用前景。特异结合于肿瘤细胞的核酸适配子有利于肿瘤的诊断和治疗。抗体可以特异识别肿瘤细胞的标志物，但缺点是分子大且具有免疫原性。人源化抗体等抗体工程技术更具前景，但因易被肽酶降解和有免疫反应而导致应用受限。适配子出现十多年来，已可应用于酶链寡核苷酸实验、流式细胞仪、适配子芯片(aptamer chip)、蛋白定量及蛋白纯化等体外实验，同时具有可在体内抑制生长因子和受体的相互作用或抑制酶活性等功能，还可进行体内成像等。适配子可作为诊断和治疗试剂，用于诊断时可识别与结合特定靶分子，用于治疗时可作为功能阻断物质或者直接阻断疾病进程。适配子可以作为肿瘤发生和发展过程中具有重要功能的蛋白质的直接抑制剂。然而到目前为止，还没有出现成功将SELEX筛选技术用于开发诊断及治疗肝癌转移复发的试剂的报道。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种能特异性地、高亲和力地结合高转移潜能肝癌细胞HCCLM9(Wu et al. Journal of Experimental&ClinicalCancer Research 2010, 29:17, http://www. jeccr. com/content/29/1/17)膜表面的单链DNA适配子；本专利技术的第二个目的在于提供一种上述单链DNA适配子耦联荧光量子点形成的功能化生物分子探针，能识别组织切片中的肝癌细胞；本专利技术的第三个目的在于提供一种上述单链DNA适配子耦联磁性颗粒的复合物，能捕获外周血模拟环境中的循环肝癌细胞；作为一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种上述单链DNA适配子或其衍生物在制备肝癌靶向诊断试剂中的应用。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种上述单链DNA适配子或其衍生物在制备靶向性抗肝癌转移复发药物或抗肝癌转移复发 药物靶向输送载体中的应用。为了实现上述诸目的，本专利技术采用了以下技术方案一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，其筛选及初步的应用研究过程如下①随机ssDNA文库的构建和引物的合成构建长度为76nt的随机文库，两端为固定序列，中间为40个核苷酸随机序列，库容量大约为IO15-IO16,根据随机ssDNA文库两端固定序列设计上下游引物。ssDNA文库的序列5’ -ATC CAG AGT GAC GCA GCA- (MO)-TGG ACA CGG TGG CTT AGT-3’，其中 N 代表 A，T，C，G 四个随机碱基;上游引物 P1:5’-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-3’;下游引物 P2 :5，_ACTAAG CCA CCG TGT CCA-3’ ；②SELEX筛选过程a :高转移潜能肝癌细胞HCCLM9 (靶细胞)和低转移潜能肝癌细胞MHCC97-L (消减细胞)的培养；b :消减细胞、靶细胞与ssDNA文库孵育；c :与靶细胞结合ssDNA的扩增；d 链酶亲和素磁珠法制备ssDNA文库；e :重复上述过程，共进行8-12轮筛选。③流式细胞仪监测DNA适配子的各轮筛选富集情况a:制备FITC标记ssDNA ;b :靶细胞的处理；c :靶细胞与FITC标记ssDNA孵育；d :流式细胞术检测，通过荧光强度值的大小比较富集的情况。④克隆与测序经多轮筛选得到的ssDNA用PCR扩增dsDNA，回收纯化连接T载体，经蓝白斑筛选，随机挑选多个克隆进行序列测定。⑤DNA适配子一、二级结构分析和预测及同源序列分析⑥流式细胞术检测DNA适配子与高转移潜能肝癌细胞HCCLM9 (靶细胞)结合的亲和力解离常数Kd。⑦DNA适配子特异性的鉴定通过流式细胞术检测筛选得到的DNA适配子与高转移潜能肝癌细胞(HCCLM9)、低转移潜能肝癌细胞MHCC97-L、HepG2细胞、Hu7细胞、乳腺癌细胞MDA-MB-231、肺癌细胞H1299、结肠癌细胞SW48、胃癌细胞MGC803、宫颈癌细胞HeLa、外周血白细胞WBC的亲合力以鉴定其特异性。⑧通过荧光显微镜成像和流式荧光强度变化，初步分析ssDNA适配子与靶细胞的结合位点用蛋白酶K处理靶细胞后，用FITC标记的ssDNA适配子与靶细胞作用后，上流式检测。初步分析用蛋白酶处理靶细胞后，适配子与靶细胞结合的能力是降低或是升高，从而判断ssDNA适配子是否与靶细胞表面的膜蛋白分子结合。⑨应用量子点荧光成像初步分析ssDNA适配子作为分子探针识别组织切片中的肝癌细胞的能力分别以培养的肝癌细胞、肝癌肺转移动物模型肝脏和肺脏组织切片、临床确诊的若干例肝癌组织切片为研究对象，以筛选出的核酸适配子为识别分子，用量子点作为标记物，采用间接荧光法，研究其对肝癌细胞的特异性识别。⑩磁性颗粒与高亲和力特异结合 靶细胞表面单链DNA适配子耦联，研究该复合物捕获外周血模拟环境中循环肿瘤细胞的效能把不同数量(IO5个、IO4个、IO3个、IO2个)的肝癌细胞HCCLM9分别混匀到ImL健康人的外周血中，NH4Cl法除去红细胞，然后与BIO标记的核酸适配子孵育；充分洗涤后，室温下与链酶亲和素磁珠孵育；在磁力架上充分洗涤后，铺在多聚赖氨酸处理的玻片上，固定后，以AFP抗体/CK19抗体/DAPI鉴定捕获的细胞。与现有技术相比，本专利技术的优点和有益效果在于本专利技术以遗传背景相同但转移潜能有明显差异的两个肝癌细胞系MHCC97-L (低转移)和HCCLM9 (高转移)分别为消减靶子和筛选靶子，采用消减cell-SELEX技术，筛选出了能特异识别高转移潜能肝癌细胞HCCLM9而不识别低转移潜能肝癌细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子，其核苷酸核心序列如SEQ？ID？No.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子，其核苷酸核心序列如SEQ ID No. 2所示。2.一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。3.含有权利要求I或2所述单链DNA适配子的衍生物，所述衍生物为以下的任意一种 X将所述适配子进行核苷酸取代后得到的RNA核酸适配子衍生物； I将所述适配子骨架改造为硫代磷酸酯骨架后得到的核酸适配子衍生物； S将所述适配子改造为肽核酸后得到的核酸适配子衍生物； ■I将所述适配子连接标记分子或生...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪付兵，李雁，刘少平，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：
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