新型的嵌合TNF配体制造技术

本发明专利技术是关于编码嵌合ＴＮＦα的分离的多聚核苷酸序列，包括编码非ＴＮＦα的肿瘤坏死因子配体的结构域或亚结构域的第一核苷酸序列，其中被编码的结构域或亚结构域替换了天然ＴＮＦα的切割位点，和编码结合于ＴＮＦα受体的天然ＴＮＦα的结构域或亚结构域的第二核苷酸序列。被编码的嵌合ＴＮＦα明显地对来自细胞表面的切割不敏感，导致可以在细胞表面增加能够结合于ＴＮＦα受体的ＴＮＦα的浓度。通过往感兴趣的细胞中导入编码在细胞表面表达的嵌合ＴＮＦα的分离的多聚核苷酸序列，嵌合ＴＮＦα因此可以用于诱导表达ＴＮＦα受体的细胞的凋亡，诱导免疫系统细胞的活化和治疗瘤形成细胞。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物化学、免疫学、基因工程和药学领域。特别地，本专利技术与新型的嵌合配体有关，当该嵌合配体在细胞的表面表达时，比相应的天然配体更稳定。
技术介绍
免疫系统通过把恶性细胞识别为外来物，然后把它排除出身体，从而清除恶性细胞。为了完成这一过程，免疫系统产生抗体应答和细胞应答。这两种应答需要免疫系统的很多不同的细胞间的相互作用(Abbas，Cellular and Molecular Immunology，2000)。免疫反应通常始于T淋巴细胞(T细胞)，在T淋巴细胞表面有T细胞受体(TCR)，该受体与同II类主要组织相容性复合物(MHC)分子联合的由抗原衍生的肽结合。T细胞还在其表面表达各种多肽，它们被称作“配体”，因为它们与免疫介导的应答相关的细胞上的受体结合，如以下更详细的描述。当T细胞受体结合于MHC联合抗原，如来源于恶性细胞的抗原时，细胞被活化，而且在其表面表达配体。配体仅仅在细胞表面存在很短的时间，一旦它从细胞表面去除，T细胞结合于含有受体的细胞的能力就会丧失。其中一个这样的配体被称为肿瘤坏死因子(TNFα)。当表达于活化的T细胞表面时，TNFα结合于受体，例如表达于免疫细胞、非免疫细胞和恶性细胞表面的TNF受体I(也称为“p55”或者“CD120a”)和TNF受体II(也称为“p75”或者“CD120b”)。在这些免疫细胞中包括统称为“抗原呈递细胞”(APC)的细胞，因为它们表达可以结合抗原并且将抗原呈递给T细胞的表面多肽。APC的例子包括树突细胞和B细胞。APC的表面还具有各种受体分子，可以与免疫系统的其它细胞相互作用。T细胞表达的配体与APC和恶性细胞上的受体分子之间的相互作用导致细胞裂解反应，破坏恶性细胞并将它们从体内清除。TNFα是配体大家族中的一员，统称为TNF超家族(Gruss等，Cytokines Mol Ther，175-105，1995和Locksley等，Cell，104487-501，2001)。TNF超家族的成员包括Fas配体(“FasL”)，TNFα，LTα，淋巴毒素(TNFβ)，CD154，TRAIL，CD70，CD30配体，4-1BB配体，APRIL，TWEAK，RANK配体，LIGHT，AITR配体，ectodysplasin，BLYS，VEG1和OX40配体。TNF超家族成员具有保守的二级结构，包括四个结构域结构域I，细胞内结构域；结构域II，跨越细胞膜的结构域，被称为跨膜结构域；结构域III，由最靠近细胞膜的细胞外氨基酸组成；和结构域IV，远端的细胞外结构域(Kipps等，WO98/26061出版于1998年6月18日)。典型地，结构域IV的至少一部分可以从母体分子中切除。被切除的片段通常表现出与完整的配体相同的生物学活性，它通常被称为TNF家族成员的“可溶形式”。1.TNFα的生物学活性TNFα具有两种活性形式。一种是与膜整连的形式(mTNFα)，也称为前TNFα。此外，有一种通过mTNFα蛋白裂解切割产生的可溶形式(sTNFα)。TNF通过两种不同的受体CD120a和CD120b进行信号传导。总的来说，由于CD120a中存在细胞质死亡结构域，藉由CD120a的信号传导诱导细胞凋亡。与之相反，CD120b缺乏死亡结构域，它一般诱导细胞的活化，如增殖和共刺激分子的表达。后面的这些效应在正常的B细胞中很突出，其中TNFα诱导重要的共刺激分子的表达，包括CD80和CD54(Ranheim和Kipps，Cell lmmunol.161226，1995)。已经表明一种称作TACE(TNFα转化酶)的间质金属蛋白酶(mmp)释放TNFα的活性形式(BIack等，Nature，385729-733，1997和Moss等，Nature，385733-736，1997)。已经发现TACE通过在氨基酸残基丙氨酸76和缬氨酸77之间切割前TNFα而释放sTNFα。此外，切割依赖于从缬氨酸77到脯氨酸88的大约12个氨基酸的mmp识别序列(Decoster et al，J.Biol.Chem，27018473-18478，1995和Tang et al，Biochemistry，358226-8233，1996)，因为缺失这一mmp识别位点的9到12个氨基酸会抑制母体TNFα分子的切割(Decoster等，J Biol Chem，27018473-18478，1995和Perez等，Cell，63251-258，1990)。然而，由于在TNFα中存在多个切割位点，缺失这一切割位点并不完全消除sTNFα的产生。(Mueller等，J.Biol.Chem，27438112-38118，1999)。II.在治疗人类疾病中目前的TNFα构造的缺点由于TNFα可以诱导表达CD120a的细胞的凋亡，同时通过藉由CD120b的细胞激活增强免疫应答，研究组试图使用TNFα作为抗肿瘤化合物。然而，由于在不引起系统毒性的情况下细胞因子不能达到高的局部浓度，所以使用重组的可溶性TNFα对于大多数癌症的免疫治疗表现出很小的临床效果。一般的副作用包括发热，寒战，食欲缺乏，高血压，肝脏异常，血液学变化(Spriggs等，Ciba Found Symp，131206-227，1987)。而且，甚至表达为与膜整连的前TNFα的野生型(wt)TNFα的基因转移，在不引起系统毒性的情况下，也不能达到高的TNF局部表达，因为它很快代谢成可溶性的细胞因子。由于TNFα的可溶形式是TNFα作为治疗化合物失败的一般原因，我们假设膜稳定的TNFα的设计可能允许局部传送TNFα分子而同时降低与可溶性TNFα相关的系统毒性的风险。已知目前TNFα应用的缺点，因此明显地需要膜稳定的TNFα，它既保持天然TNFα的受体结合功能，但又对切割不敏感，因此较不可能产生可溶性的TNFα。本专利技术提供了这样的膜稳定的TNFα配体。专利技术概述本专利技术涉及新颖的嵌合TNFα，这种新颖的嵌合TNFα在表达于细胞表面时较未嵌合的TNFα稳定。这些新颖的配体是嵌合的，因为它们包含TNF超家族至少两种不同成员的结构域或亚结构域。具体的，至少一个含有“切割位点”的TNF结构域或亚结构域用TNF超家族另一个配体相应的结构域或亚结构域替换，优选的是CD154，CD70，FasL或者TRAIL。此外，嵌合的配体包含TNFα的结构域或亚结构域，主要用于结合同源的TNFα受体。本专利技术也涉及新颖的编码嵌合TNFα的多核苷酸序列，含有新颖的多聚核苷酸序列的表达载体，以及产生新颖的嵌合配体的方法。最后，本专利技术涉及应用表达载体，改善转染细胞的免疫学活性和治疗恶性肿瘤的方法。所以，本专利技术的一个方面是涉及编码嵌合TNFα的分离的多聚核苷酸序列，包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，第一核苷酸序列编码非TNFα的肿瘤坏死因子配体的结构域或亚结构域，其中编码的结构域或亚结构域替换了天然TNFα的切割位点，第二核苷酸序列编码天然TNFα的结构域或亚结构域，它结合于TNFα受体。本专利技术的一个方面是以上的分离的多聚核苷酸序列，其中第一核苷酸序列编码其它的肿瘤坏死因子配体的结构域III，或结构域III的亚结构域。本专利技术的一个方面是以上的分离的多聚核苷酸序列，其中第一核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码嵌合ＴＮＦα的分离的多聚核苷酸序列，包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，第一核苷酸序列编码非ＴＮＦα的肿瘤坏死因子配体的结构域或亚结构域，其中被编码的结构域或者亚结构域替换了天然ＴＮＦα的切割位点，第二核苷酸序列编码结合ＴＮＦα受体的天然ＴＮＦα的结构域或亚结构域。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：CE普鲁萨克，TJ基普斯，MJ坎特韦尔，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：US[美国]