辅助鉴定轮状病毒的方法及其专用引物技术

本发明专利技术公开了一种辅助鉴定轮状病毒的方法及其专用引物。本发明专利技术提供的专用引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。采用该组专用引物可以通过环介导逆转录等温扩增技术鉴定轮状病毒，进而应用于轮状病毒在各种水体(污水、再生水、地表水、饮用水)及肠道病患者(人、兽)粪便中的监测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种辅助鉴定轮状病毒的方法及其专用引物。
技术介绍
婴幼儿秋季腹泻就是一种病毒感染性腹泻。据调查，这种腹泻有80% -90%是由轮状病毒引起的。该病毒在电子显微镜下观察呈圆球状，中间的壳体像车轮的辐条一样呈向外放射状排列，外边的壳体类似车轮的外缘，形态极像车轮，故起名叫轮状病毒(Rotavirus)。轮状病毒在全世界都有分布,早在30年代就曾在欧美国家流行过,在亚洲、非洲、拉丁美洲等发展中国家，是导致婴幼儿死亡的主要原因之一。我国自50 开始 ，也曾先后在20多个省市发生过流行，其流行范围几乎遍及全国。这种病毒还曾在产科病房的婴儿室中引起过相互感染，导致多名婴儿发生腹泻，有的甚至造成死亡。据测试，轮状病毒在50°C的高温下，I小时仍然不会死亡；在_201的严寒条件下，可以存活7年；在-70°C的环境中可以长期保存。它对酸碱也有较强的耐受性，一般的洗涤剂对它毫无杀灭作用，但在外界环境中不能繁殖。正是由于该病毒的这些特点，才使它在不利的环境中能长期潜伏等待、一旦有机会进入人体，便会大量繁殖致病；然后随粪便排出体外，污染外部环境。重新感染别人。这样周而复姑，至今人类还没有找到能有效杀灭该病毒的有效药物。环介导逆转录等温扩增技术(LAMP)是在实验过程中使核酸链通过在等温环境中的循环置换扩增实现对靶序列的放大，而达到检测目的。由于反应中使用了两对特异性引物，只有两对引物均与特异的靶序列结合时扩增反应才能进行，因此这种检测方法的特异性很高。其中一对特殊的引物的5’端含有一端与下游扩增产物互补的序列，因此，这对引物的单链产物就形成了一个类似哑铃状回文结构，这种结构正好为下一步等温置换扩增反应提供了一个可被周而复始利用的模板，从而保证了扩增的持续进行，最终，扩增产物在核酸电泳胶上形成连续的梯状条带。从LAMP的原理和特点上不难看出，该方法在RNA病毒的检测方面应该有着传统基因诊断方面无法比拟的优势，与一些常规的基因检测手段相比，该技术在可操作性和检测时间及设备要求方面具有更大的优势。这主要体现在以下几个方面首先，它的检测时间可以缩短到两个小时以内，灵敏度可以达到检测10个拷贝左右的病毒核酸分子；除了应用一些常用的聚合酶外，对硬件设备基本无特殊要求，在普通的生物实验室就可完成这项检测工作；第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，在实验设施中反转录与扩增过程在恒温条件下一步完成，没有核酸的变复性过程，不但节省了大量的时间又减少了 RNA酶和扩增核酸的污染机会；第三，扩增反应只有在四条引物完全与识别的靶序列中六个结合区匹配的情况下才能顺利进行，从而大大提高了反应的特异性；第四，LAMP的扩增反应中可以形成可视的焦磷酸酶沉淀，因此肉眼可观察到阳性反应管中的白色混浊物；第五，也可在LAMP反应体系中加入HNB染料，即可通过观察颜色变化指示阳性结果
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种辅助鉴定轮状病毒的方法及其专用引物。本专利技术提供的辅助鉴定轮状病毒的专用引物(引物组合物)，为如下(a)或(b)(a)由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的专用引物(引物组合物)；(b)由序列表的序列I所示DNA的反向互补DNA、序列表的序列2所示DNA的反向互补DNA、序列表的序列3所示DNA的反向互补DNA和序列表的序列4所示DNA的反向互补DNA组成的专用引物(引物组合物)。所述专用弓I物可用于制备辅助鉴定轮状病毒的试剂盒。本专利技术还保护一种辅助鉴定轮状病毒的试剂盒，包括所述专用引物(引物组合物)。 所述试剂盒还可包括阳性质粒；所述阳性质粒可为含有序列表的序列5所示DNA的质粒。所述阳性质粒具体可为将轮状病毒VP7基因部分序列(核苷酸如序列如序列表的序列5自5’末端第571-834核苷酸所示)反向插入pGH载体的SmaI酶切位点得到的重组质粒。所述弓I物或所述试剂盒可用于辅助鉴定轮状病毒。本专利技术还保护一种辅助鉴定轮状病毒的方法，包括如下步骤(I)提取待测病毒的RNA ；(2)将步骤(I)提取的RNA采用所述专用引物(引物组合物)进行环介导逆转录等温扩增；(3)根据步骤(2)的扩增产物鉴定待测病毒是否为轮状病毒。所述环介导逆转录等温扩增的反应程序具体可为64_65°C恒温扩增1-1. 5h。所述步骤(3)具体可为将环介导逆转录等温扩增的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳显示的扩增条带鉴定待测病毒是否为轮状病毒。所述步骤(3)具体还可为将环介导逆转录等温扩增的扩增产物用限制性内切酶Fok I进行酶切鉴定，根据酶切产物鉴定待测病毒是否为轮状病毒。如果Fok I酶切后得到280bp、193bp和78bp三条DNA片段，待测病毒为候选的轮状病毒。所述待测病毒具体可为人类星状病毒、轮状病毒或诺如病毒。所述专用引物(引物组合物)或所述试剂盒可用于辅助检测待测样本中是否含有轮状病毒。本专利技术中，设计了用于鉴定轮状病毒的一组专用引物(引物组合物)，采用该组专用引物(引物组合物)可以通过环介导逆转录等温扩增技术鉴定轮状病毒，进而应用于轮状病毒在各种水体(污水、再生水、地表水、饮用水)及肠道病患者(人、兽)粪便中的监测。应用本专利技术的专用引物鉴定轮状病毒，具有准确、特异、灵敏、快捷的优势，主要体现在以下几个方面首先，扩增反应只有在四条引物完全与识别的靶序列中六个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善；第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，加之扩增反应在65°C等温条件下进行，没有核酸的变复性过程，不但节省了大量的时间又减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会，从而提高了检测的灵敏性和安全性；第三，所有的扩增反应在65°C左右等温条件下进行，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求，有利于基层水质监测及卫生防疫等的推广；第四，较RT-PCR缩短了检测所需的时间(0.5-2小时即可完成)。附图说明图I为轮状病毒质粒的结构示意图。图2为实施例2中反应体系中采用不同浓度的镁离子的电泳图。图3为实施例2中反应体系中采用不同浓度的甜菜碱的电泳图。图4为实施例2中采用不同反应温度的电泳图。图5为实施例2中采用不同反应时间的电泳图。 图6为实施例3的步骤2中阳性对照和空白对照的观察结果。图7为实施例3的步骤2中人类星状病毒、轮状病毒和诺如病毒的观察结果。图8为实施例3的步骤3的⑴中阳性对照和空白对照的观察结果。图9为实施例3的步骤3的(I)中人类星状病毒、轮状病毒和诺如病毒的观察结果。图10为实施例3的步骤3的⑵中阳性对照和空白对照的观察结果。图11为实施例4中阳性对照和空白对照的观察结果。图12为实施例5中各稀释液的观察结果。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中用作阴性对照的水均为天根公司的RNase-free ddH20。AMV反转录酶Promega,美国。Bst-DNA聚合酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
辅助鉴定轮状病毒的专用引物，为如下(a)或(b)：(a)由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的专用引物；(b)由序列表的序列1所示DNA的反向互补DNA、序列表的序列2所示DNA的反向互补DNA、序列表的序列3所示DNA的反向互补DNA和序列表的序列4所示DNA的反向互补DNA组成的专用引物。

【技术特征摘要】
1.辅助鉴定轮状病毒的专用引物，为如下(a)或(b) (a)由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的专用引物； (b)由序列表的序列I所示DNA的反向互补DNA、序列表的序列2所示DNA的反向互补DNA、序列表的序列3所示DNA的反向互补DNA和序列表的序列4所示DNA的反向互补DNA组成的专用引物。2.权利要求I所述专用引物在制备辅助鉴定轮状病毒的试剂盒中的应用。3.一种辅助鉴定轮状病毒的试剂盒，包括权利要求I所述专用引物。4.权利要求I所述专用引物或权利要求3所述试剂盒在辅助鉴定轮状病毒中的应用。5.一种辅助鉴定轮状病毒的方法，包括如下步骤 (1)提取待测病毒的RNA； (2)将步骤(I)提取的RNA采用权利要求I所述专用引物进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：何晓青，杨丽，韦玉梅，朱轶，程莉，王子健，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：