本发明专利技术公开了一种测定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法，准备好材料、试剂及血液标本后，依次进行单克隆抗体的生物素标记，生物素标记单抗的鉴定，sCD28标准工作曲线的绘制，Graves病人血液中T细胞的分离和纯化，Graves病人T细胞的表型分析，Graves病人血液中可溶性CD28含量的测定，免疫印迹法分析患者血液中可溶性CD28，可溶性CD28对树突状细胞分泌的细胞因子的影响，可溶性CD28对树突状细胞NF-κB核转位的影响等测定步骤并进行统计学分析。本测定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法，对进一步探讨联合其他可溶性共刺激分子建立体外检测的优化方案，和在自身免疫性疾病的临床诊断、治疗及预后评估中的促进意义，为寻找新的免疫干预手段提供实验依据和理论基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学领域，具体涉及一种测定Graves病病患者血液中可溶性⑶28含量的方法。
技术介绍
Graves病又称弥漫性甲状腺肿伴甲状腺功能亢进(甲亢)或毒性弥漫性甲状腺肿，是甲亢中最常见的类型。也是一种伴甲状腺激素分泌增多的器官特异性自身免疫性疾病，其病因和发病机理尚不明确。目前认为其免疫致病机制是由于甲状腺细胞表面促甲状腺激素(TSH)受体作为抗原刺激机体所产生的抗体(TRAb)模拟TSH的作用，与TSH受体结合，使甲状腺滤泡细胞持续性激发、形成和分泌过量的甲状腺素而引起甲亢。近年来，人们越来越重视免疫致病机制在Graves病发病中的作用，希望能寻找免疫干预手段作为治疗Graves病的新途径。自身抗体TRAb是重要的效应因子，是发病中较靠下游的环节，不是Graves病发病的启动因子，为此，近年来研究者们把目光开始投向于开启甲状腺异常免疫应答的上游环节一自身反应性T细胞的活化及相关调节分子的研究。大量研究表明，多对共刺激分子的受体-配体分子在免疫病理应答的不同阶段以各自独特的方式参与了类风湿性关节炎、红斑狼疮和实验性自身脑脊髓膜炎等自身免疫性疾病的病理过程。Schmidt等首次报道了在类风湿性关节炎患者的外周血中存在一群独特的CD4+T细胞，其表面完全缺乏共刺激分子CD28的表达。近年来人们陆续发现，在各种慢性炎症状态下，如多发性硬化症、不稳定性心绞痛、Wegener肉芽肿病和强直性脊柱炎等患者的外周血中均有异常⑶4+CD28_T细胞的高频存在。此外，在年龄大于65岁的老年人的外周血中亦发现有该群特殊的CD4+CD28_T细胞存在。业已有研究证实，在类风湿性关节炎病人中，当患者出现类风湿结节和关节外全身症状时，⑶4+CD28_T细胞数量显著增加；同样，在冠脉综合症中，⑶4+CD28_T细胞的数量与患者发生急性冠脉事件的危险性呈明显正相关，发生急性冠脉综合症患者体内的炎症性粥样斑块局部可见该群细胞呈克隆性扩增[12]。进一步研究证实，⑶4+CD28—T细胞本质上是一群具有独特生物学特性和功能的自身反应性T细胞。国内外研究业已证实，共刺激分子，不论受体还是配体，均以膜型和可溶性两种形式存在，分别表达于细胞膜上和分泌于体液中，参与了共刺激信号的介导和调节。有文献报道，可溶性CD28分子主要来源于膜型CD28分子的脱落和mRNA水平剪接、翻译后的直接分泌。但也有文献经RT-PCR证实，系统性红斑狼疮病人血液中的可溶性CD28分子为全长基因所编码，也就是说，病人血液中的可溶性CD28分子为细胞膜CD28分子脱落所致。另有体外实验结果表明，可溶性CD28分子与多发性硬化症、硬皮病等自身免疫性疾病的严重程度密切相关，并具有抑制T细胞增殖的功能。但可溶性CD28分子在Graves病中的临床诊断价值及其在体内免疫应答和免疫调节中发挥何种作用，在肿瘤、免疫缺陷病、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的发生、发展、转归中又有何意义，目前仍不清楚。基于以上原因，专利技术一种有效的Graves病患者血液中可溶性⑶28含量的测定及、作用机制方法，已成为本
内丞待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种测定Graves病患者血液中可溶性⑶28含量的方法，为探讨Graves病的实验室研究和寻找可溶性CD28分子参与该病发病机制，提供具有重要基础研究价值和潜在的临床应用价值的生物学参数。本专利技术的一种测定Grave s病患者血液中可溶性⑶28含量的方法，具体步骤如下步骤I)准备材料、试剂及血液标本牛血清；RPMI1640 或 DMEM 基础培养基；CD28 单抗 2D5、2F5、3B6、3F8 和 8G8 ;亲和层析柱Protein G免疫亲和层析柱；rh⑶28/Fc重组蛋白；琥珀酰羟基生物素；二甲基亚砜；4%多聚赖氨酸；streptavidin-HRP ；avidin-PE ;酶标测定板；酶标测定仪；培养瓶；实验仪器C02培养箱、离心机；倒置显微镜及荧光显微镜；流式细胞仪；TMB底物；人促甲状腺激素(hTSH)试剂盒；淋巴细胞分离液；鼠抗人PE直接标记⑶3、⑶4、⑶8、⑶28、NF- k B单克隆抗体；血液标本选取多例初发Graves病患者的血液标本作为实验组，准备健康人血液标本多份作为正常对照组；步骤2)单克隆抗体的生物素标记用碳酸盐缓冲液将纯化的2D5单抗的浓度调整为200 ii g/ml，取其I. Oml在50mlCBS中4°C透析过夜,移入Eppendof管,加入lmg/ml的生物素40 V- I,避光震荡4h, 0. Olmol/L pH7. 2 PBS中4°C透析72h，分装后于_20°C保存备用；步骤3)生物素标记单抗的鉴定将⑶28-T转基因细胞用PBS洗涤后，以5X IO5/管的剂量分装于小试管中，以20 iil/管的剂量加入生物素标记的单抗2D5，4°C反应45min，充分洗涤后以IOyl/管的剂量加入avidin-PE，再于4°C反应45min，充分洗涤后用流式细胞仪分析，同时设置阴性对昭.>、、、 步骤4) s⑶28标准工作曲线的绘制用2F5mAb包被经0. 01 %多聚赖氨酸预处理的酶联检测板，4°C过夜，含0. 01 %Tween-20的PBS洗涤后，以3% BSA封闭过夜，洗涤后加入0 16ng/ml的标准品rhCD28/Fe重组蛋白的梯度稀释液，反应2h，充分洗涤后，再分别加生物素标记单抗和HRP标记链霉亲和素，37 V反应Ih，洗涤后，加TMB底物室温反应15min，用上述方法测定A45tl,每个梯度做3个复孔，以s⑶28/Fc的浓度为横坐标，A450值为纵坐标，绘制s⑶28的标准工作曲线；步骤5) Graves病人血液中T细胞的分离和纯化抽取肝素抗凝的Graves病患者或健康人新鲜外周血IOml,用pH7. 2的无Ca2+、Mg2+Hankj s液作I : 2稀释后，轻悬于淋巴细胞分离液上，以1400rpm的转速离心30min,弃上清；吸取界面云雾状层细胞，加5倍体积的Hank’s液,混勻，2000rpm,离心IOmin,弃上清；以1400rpm的转速转lOmin，重复洗涤一次，计数，用含10% FCS的RPMI1640完全培养基调整细胞浓度为3X 106/ml，置6孔塑料培养板于37°C、5% CO2培养箱孵育2h以去除贴壁的单核细胞及B细胞等，收集非贴壁细胞悬液，经E花环结合法富集T细胞，经流式细胞仪分析，⑶3+T细胞达到90%以上，液氮冻存备用；步骤6) Graves病人T细胞的表型分析液氮中复苏冻存的患者和健康对照组的纯化T细胞，用PBS洗涤2遍后，以5X IO5/管的剂量分装于小试管中，分别加入⑶3、⑶4、⑶8、⑶28和ICOS分子的PE直标抗体IOyl及小鼠IgG-PE 10 u I作为阴性对照，于4°C避光反应45min，经含5%小牛血清的PBS洗涤后，加入0.5ml PBS后，用流式细胞仪分析T细胞表型，图象处理运用EXPO v. 2 cytometersoftware分析软件。步骤7) Graves病人血液中可溶性CD28含量的测定收集T细胞培养上清、Graves’病人血液中和对照组正常健康人血浆0. 5ml。取包被抗体2F5已经预包被的检测板，加入上本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法，其特征在于，具体步骤为：步骤1)准备材料、试剂及血液标本：牛血清；RPMI1640或DMEM基础培养基；CD28单抗2D5、2F5、3B6、3F8和8G8；亲和层析柱：Protein？G免疫亲和层析柱；rhCD28/Fc重组蛋白；琥珀酰羟基生物素；二甲基亚砜；4％多聚赖氨酸；streptavidin？HRP；avidin？PE；酶标测定板；酶标测定仪；培养瓶；实验仪器：CO2培养箱、离心机；倒置显微镜及荧光显微镜；流式细胞仪；TMB底物；人促甲状腺激素试剂盒；淋巴细胞分离液；鼠抗人PE直接标记CD3、CD4、CD8、CD28、NF？κB单克隆抗体；血液标本：选取多例初发Graves病患者的血液标本作为实验组，准备健康人血液标本多份作为正常对照组；步骤2)单克隆抗体的生物素标记用碳酸盐缓冲液将纯化的2D5单抗的浓度调整为200μg/ml，取其1.0ml在50ml？CBS中4℃透析过夜，移入Eppendof管，加入1mg/ml的生物素40μl，避光震荡4h，0.01mol/L？pH7.2PBS中4℃透析72h，分装后于？20℃保存备用；步骤3)生物素标记单抗的鉴定将CD28？T转基因细胞用PBS洗涤后，以5×105/管的剂量分装于小试管中，以20μl/管的剂量加入生物素标记的单抗2D5，4℃反应45min，充分洗涤后以10μl/管的剂量加入avidin？PE，再于4℃反应45min，充分洗涤后用流式细胞仪分析，同时设置阴性对照；步骤4)sCD28标准工作曲线的绘制用2F5mAb包被经0.01％多聚赖氨酸预处理的酶联检测板，4℃过夜，含0.01％Tween？20的PBS洗涤后，以3％BSA封闭过夜，洗涤后加入0～16ng/ml的标准品rhCD28/Fc重组蛋白的梯度稀释液，反应2h，充分洗涤后，再分别加生 物素标记单抗和HRP标记链霉亲和素，37℃反应1h，洗涤后，加TMB底物室温反应15min，用上述方法测定A450，每个梯度做3个复孔，以sCD28/Fc的浓度为横坐标，A450值为纵坐标，绘制sCD28的标准工作曲线；步骤5)Graves病人血液中T细胞的分离和纯化抽取肝素抗凝的Graves病患者或健康人新鲜外周血10ml，用pH7.2的无Ca2+、Mg2+？Hank’s液作1∶2稀释后，轻悬于淋巴细胞分离液上，以1400rpm的转速离心30min，弃上清；吸取界面云雾状层细胞，加5倍体积的Hank’s液，混匀，2000rpm，离心10min，弃上清；以1400rpm的转速转10min，重复洗涤一次，计数，用含10％FCS的RPMI1640完全培养基调整细胞浓度为3×106/ml，置6孔塑料培养板于37℃、5％CO2培养箱孵育2h以去除贴壁的单核细胞及B细胞等，收集非贴壁细胞悬液，经E花环结合法富集T细胞，经流式细胞仪分析，CD3+T细胞达到90％以上，液氮冻存备用；步骤6)Graves病人T细胞的表型分析液氮中复苏冻存的患者和健康对照组的纯化T细胞，用PBS洗涤2遍后，以5×105/管的剂量分装于小试管中，分别加入CD3、CD4、CD8、CD28和ICOS分子的PE直标抗体10μl及小鼠IgG？PE？10μl作为阴性对照，于4℃避光反应45min，经含5％小牛血清的PBS洗涤后，加入0.5ml？PBS后，用流式细胞仪分析T细胞表型，图象处理运用EXPO？v.2？cytometer？software分析软件。步骤7)Graves病人血液中可溶性CD28含量的测定收集T细胞培养上清、Graves’病人血液中和对照组正常健康人血浆0.5ml。取包被抗体2F5已经预包被的检测板，加入上述收集待测样品100μl，37℃水浴反应2h，充分洗涤后，加入生物素标记的单抗2D5，再于37℃水浴反应1h充分洗涤后，加入streptavidin？HRP，反应洗涤后，加入临时配制的底物TMB，室温反应15min后，用2mol/L？H2SO4终止酶与底物的反应，于酶标仪测定A450，每个样本设置三个复孔，同时用rhCD28/Fc重组蛋白标准品制作线性标准曲线， 以分析Graves病人血浆中可溶性CD28含量；步骤8)免疫印迹法分析患者血液中可溶性CD28分别收集T细胞培养上清、经PHA活化的T细胞培养上清、健康人血清和Graves’病人血清，在上述蛋白质样品中加入1×SDS凝胶加样缓冲液，于沸水中煮沸3min使蛋白质变性，配制8％的积层胶和5％的分离胶，恒压100伏特进行SDS？PAG...
【技术特征摘要】
1. 一种测定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法,其特征在于,具体步骤为 步骤I)准备材料、试剂及血液标本 牛血清；RPMI1640或DMEM基础培养基；CD28单抗2D5、2F5、3B6、3F8和8G8 ;亲和层析柱Protein G免疫亲和层析柱；rh⑶28/Fc重组蛋白；琥珀酰羟基生物素；二甲基亚砜；4%多聚赖氨酸；streptavidin-HRP ；avidin-PE ;酶标测定板；酶标测定仪；培养瓶；实验仪器=CO2培养箱、离心机；倒置显微镜及荧光显微镜；流式细胞仪；TMB底物；人促甲状腺激素试剂盒；淋巴细胞分离液；鼠抗人PE直接标记⑶3、⑶4、⑶8、⑶28、NF-K B单克隆抗体； 血液标本选取多例初发Graves病患者的血液标本作为实验组，准备健康人血液标本多份作为正常对照组； 步骤2)单克隆抗体的生物素标记 用碳酸盐缓冲液将纯化的2D5单抗的浓度调整为200 u g/ml，取其I. Oml在50ml CBS中4°C透析过夜,移入Eppendof管，加入lmg/ml的生物素40 V- I,避光震荡4h, 0. 01mol/LpH7. 2PBS中4°C透析72h，分装后于_20°C保存备用； 步骤3)生物素标记单抗的鉴定 将⑶28-T转基因细胞用PBS洗涤后，以5 X IO5/管的剂量分装于小试管中，以20 iil/管的剂量加入生物素标记的单抗2D5,4°C反应45min,充分洗漆后以IOy I/管的剂量加入avidin-PE，再于4V反应45min，充分洗涤后用流式细胞仪分析，同时设置阴性对照； 步骤4) sCD28标准工作曲线的绘制 用2F5mAb包被经0.01 %多聚赖氨酸预处理的酶联检测板，4 °C过夜，含0. 01 %Tween-20的PBS洗涤后，以3% BSA封闭过夜，洗涤后加入0 16ng/ml的标准品rhCD28/Fe重组蛋白的梯度稀释液，反应2h，充分洗涤后，再分别加生物素标记单抗和HRP标记链霉亲和素，37 V反应Ih，洗涤后，加TMB底物室温反应15min，用上述方法测定A45tl,每个梯度做3个复孔，以s⑶28/Fc的浓度为横坐标，A450值为纵坐标，绘制s⑶28的标准工作曲线； 步骤5) Graves病人血液中T细胞的分离和纯化 抽取肝素抗凝的Graves病患者或健康人新鲜外周血IOml,用pH7. 2的无Ca2+、Mg2+Hank’ s液作I : 2稀释后,轻悬于淋巴细胞分离液上，以1400rpm的转速离心30min,弃上清；吸取界面云雾状层细胞，加5倍体积的Hank’ s液,混勻，2000rpm,离心IOmin,弃上清；以1400rpm的转速转lOmin，重复洗涤一次，计数，用含10% FCS的RPMI1640完全培养基调整细胞浓度为3X 106/ml，置6孔塑料培养板于37°C、5% CO2培养箱孵育2h以去除贴壁的单核细胞及B细胞等，收集非贴壁细胞悬液，经E花环结合法富集T细胞，经流式细胞仪分析，⑶3+T细胞达到90%以上，液氮冻存备用； 步骤6) Graves病人T细胞的表型分析 液氮中复苏冻存的患者和健康对照组的纯化T细胞，用PBS洗涤2遍后，以5X IO5/管的剂量分装于小试管中，分别加入⑶3、⑶4、⑶8、⑶28和ICOS分子的PE直标抗体10 U I及小鼠IgG-PE 10 u I作为阴性对照，于4°C避光反应45min，经含5%小牛血清的PBS洗涤后，加入0.5ml PBS后，用流式细胞仪分析T细胞表型，图象处理运用EXPO v. 2 cytometersoftware分析软件。步骤7) Graves病人血液中可溶性⑶28含量的测定收集T细胞培养上清、Graves’病人血液中和对照组正常健康人血浆0. 5ml。取包被抗体2F5已经预包被的检测板，加入上述收集待测样品100iU，37°C水浴反应2h，充分洗涤后，加入生物素标记的单抗2D5，再于37 °C水浴反应Ih充分洗涤后，加入streptavidin-HRP,反应洗涤后，加入临时配制的底物TMB，室温反应15min后，用2mol/LH2SO4终止酶与底物的反应，于酶标仪测定A45tl,每个样本设置三个复孔，同时用rh⑶28/Fc重组蛋白标准品制作线性标准曲...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙中文，
申请(专利权)人：苏州卫生职业技术学院，
类型：发明
国别省市：
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