制备多能干细胞的材料和方法技术

本发明专利技术公开一种将体细胞重编程，制备诱导多能干（iPS）细胞的方法，得到的iPS细胞可以分化为外胚层、中胚层和内胚层的体细胞。此外本发明专利技术提供所述iPS细胞，制备和维持iPS细胞的方法，以及iPS细胞应用的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及普遍的细胞生物学领域。更具体地说，涉及到多能性干细胞的繁殖，培养条件和材料，促进传播和利用干细胞。
技术介绍
为了便于读者的理解，提供下面的说明。不能将说明提供的信息或者所引用的参考看做本专利技术的现有技术。干细胞具有自我更新能力，可无限分化，并在适当情况下， 分化成不同类型细胞。胚胎干细胞(ES细胞)从早期胚胎建立，可以长时间培养，同时保持多能分化成各种活体细胞的能力。相比之下，成体干细胞位于已发育的器官中，有能力分裂并创造其他细胞。Thomson 等(U. S. Pat. No. 5，843，780 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844，1995)首次成功分离和增殖灵长类动物多能干细胞。他们随后由人类囊胚细胞系获得人类胚胎干细胞(hES) (Science 282:114,1998)。Gearhart和同事由胎儿性腺组织获得人类胚胎生殖细胞系(hEG) (Shamblott et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998 ；U. S. Pat.No. 6，090, 622)。hES和hEG细胞具有多能性干细胞的特点，即他们可以持续培养不会分化，他们有一个正常的染色体和核型，可生产一些重要的细胞。诱导多能干细胞(iPS)来自非多能干细胞，通常是成人体细胞经人工改造的多能干细胞。2006年，山中等用四个基因(OCT-4，S0X2的，c-MYC, KLF4)转染小鼠成纤维细胞获得iPS细胞。随后，从人类成人体细胞获得了 iPS细胞。(Takahashi etal. Cell, 131:861-872(2007);Yu et al. Science, 318:1917-1920，2007) ·再生医学领域旨在帮助修补，更换，或再生受损的细胞，组织或器官。干细胞疗法有望治疗多种疾病，包括老年痴呆症，帕金森氏症，中风，脊髓损伤，心脏病，肾功能衰竭，骨质疏松，I型糖尿病，多发性硬化症，风湿性关节炎，烧伤和创伤。然而，这种治疗方法的进展受到了重重阻碍，其中包括胚胎干细胞的供体与受体免疫不相容，有可能引起免疫排斥反应。
技术实现思路
本专利技术涉及生成干细胞的方法。一方面，本专利技术为取得诱导多能干细胞的方法，即在羊膜上皮细胞滋养层上培养一个或多个体细胞。在一个实施方式中，羊膜上皮细胞是哺乳动物羊膜上皮细胞。在一个实施方式中，哺乳动物的羊膜上皮细胞来自人，猪，狗，马，牛，羊，鼠和其它啮齿类等哺乳动物。在一个实施方式中，羊膜上皮细胞为人羊膜上皮细胞(hAEC)。在一个实施方式中，羊膜上皮细胞培养不超过6代(PO-P5)。在一个实施方式中，羊膜上皮细胞为新分离的PO羊膜上皮细胞。在一个实施方式中，体细胞选自成人皮肤成纤维细胞(ADSF)，人类胚胎成纤维细胞(HEF)，小鼠成纤维细胞(MF)，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，猪成纤维细胞(PF)，猪胚胎成纤维细胞(PEF)。在一个实施方式中，体细胞是成人皮肤成纤维细胞(ADSF)。在一个实施方式中，细胞培养采用KO-DMEM培养液。在一个实施方式中，KO-DMEM培养液中包括3 -FGF (碱性成纤维细胞生长因子)，人脐静脉血清或小牛血清或胎牛血清和LIF (白血病抑制因子)。在说明性实施方式中，KO-DMEM培养液由10ng/ml P-FGF，5 %人脐血和12ng/mlLIF。一方面，本专利技术提供了按照上述方法得到的诱导多能干细胞。一方面，本专利技术提供了多能干细胞诱导的分化的体细胞。一方面，本专利技术提供了一个干细胞治疗方法，包括(1)分离和收集病人的体细胞或动物体细胞；(2)体细胞重编程为多能干细胞；(3)多能性干细胞的诱导分化；(4)移植来源于病人或动物的分化细胞；以及(5)多能干细胞用于再生和/或组织工程或育种。 附图说明图I是显示成人皮肤成纤维细胞(ADSF)在人羊膜上皮细胞(hAEC)滋养层培养的显微图片。观察7天后，出现外观上类似胚胎干细胞的细胞克隆。图2是ADSF细胞在hAEC滋养层上培养7天的克隆球干细胞标记物染色的一系列显微照片。结果显示，得到的细胞表达OCT-4，NANOG, SSEA-4, KLF4, C-MYC, TAR-81, TAR-60等常见的干细胞标记。图3A，3B, 3C表示培养7天ADSF-iPS细胞标记物定量表达及比较。图4A，4B, 4C显示了经过12天培养的各类细胞的干细胞标记物定量表达。图5是显示小鼠成纤维细胞(MF)在hAEC滋养层上培养，3天后观察到外观上类似胚胎干细胞的细胞克隆。图6是显示hAEC滋养层诱导3天小鼠成纤维细胞形成克隆球的干细胞标记物一系列染色显微照片。图7是显示猪胚胎成纤维细胞(MEF)的在hAEC滋养层培养显微图像。图8是地高辛标记抗体对小鼠染色体着丝粒的显微图像，观察到的着丝粒位于染色体的顶端，这表明没有发生hAEC染色体污染。且小鼠染色体为20对，图像中显示40条染色体，符合正常小鼠染色体的核型。图9A图9B图9C是源于iPS细胞的畸胎瘤组织结构的显微图像，A :腺体组织(内胚层);B:肌肉(中胚层);C:皮肤组织(外胚层)。hAEC诱导小鼠皮肤成纤维细胞得到的小鼠iPS的组织学的畸胎瘤。畸胎瘤的组织结构表明iPS细胞发育多能性的能力。具体实施例方式以下从详细描述了本专利技术的某些方面，模式，等同物，变化和特点，以便读者更好理解本专利技术。在本专利技术的操作中，采用了分子生物学，蛋白质生物化学，细胞生物学，免疫学，微生物学和DNA重组使用的许多传统技术。这些技术是众所周知的，可参考CurrentProtocols in Molecular Biology, Vols. I-III, Ansubel,Ed. (1997) ；Sambrook etal. , Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Ed. (Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor,NY,1989) ；DNA Cloning:A PracticalApproach, Vols.I and II, Glover, Ed. (1985) ；01igonucleotide Synthesis, Gait, Ed.(1984) ；Nucleic Acid Hybridization, Hames &Higgins, Eds. (1985) !Transcriptionand Translation, Hames &Higgins, Eds. (1984) ；Animal Cell Culture, Freshney, Ed.(1986) !Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press, 1986) ；Perbal, A Practical Guideto Molecular Cloning ；the series,Meth. Enzymol. , (Academic Press, Inc. , 1984)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells,Miller本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.获得诱导多能干细胞的方法包括以羊膜细胞为滋养层，培养体细胞足够长一段时间后，使体细胞重编程为多能干细胞。2.根据权利要求I所述的方法，其中所述羊膜细胞为羊膜上皮细胞、胚胎外间充质细胞或羊水细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述羊膜上皮细胞为哺乳动物羊膜上皮细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述哺乳动物羊膜上皮细胞来源于灵长类，猪，狗，马，牛，羊，兔，和哨齿类等。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述羊膜上皮细胞是人羊膜上皮细胞。6.根据权利要求I所述的方法，其中所述羊膜上皮细胞培养不超过6代(P0-P5)。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述羊膜上皮细胞为新鲜分离的PO羊膜上皮细胞。8.根据权利要求I所述的方法，其中所述体细胞是成熟的体细胞。9.根据权利要求I所述的方法，其中所述体细胞是来源于胚胎阶段的体细胞。10.根据权利要求I所述的方法，其中所述体细胞包括成人皮肤成纤维细胞(ADSF)，人胚胎成纤维细胞(ffiF)，小鼠成纤维细胞(MF)，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，猪成纤维细胞(PF)，猪胚胎成纤维细胞(PEF)等。...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭礼和，刘天津，
申请(专利权)人：中美赛傲上海生物技术有限公司，中美国联上海生物技术研究有限公司，
类型：发明
国别省市：